Московский Государственный университет
им. М. В. Ломоносова

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Курсовая работа

Аннотация зоны контакта тетрациклина с 16S субчастицей рибосомы Thermus thermophilus по данным РСА.

Автор: Черноризов К.А.

Научные руководители:
Головин А.В.
Анохина М.М.

Москва 2003г.

Аннотация.

В настоящее время антибиотики являются основным средством борьбы с бактериальными инфекциями человека и животных. Тетрациклин (Тс) является традиционным популярным антибиотиком широкого спектра действия, который используется как в медицине, так и ветеринарии, поэтому стало актуальным более подробное исследование для повышения эффективности действия исследуемого антибиотика.

Введение.

В клетках бактерий основной мишенью для Тс является рибосома, взаимодействие с которой приводит к ингибированию биосинтеза белка. Еще в конце 60-х годов было высказано предположение, что Тс блокирует взаимодействие аминоацил-тРНК с А-участком рибосомы. Но на сегодняшний день, точный молекулярный механизм взаимодействия Тс с бактериальной рибосомой окончательно не выяснен.

    Так, например, предполагают, что Тс не является прямым конкурентным ингибитором связывания тРНК с рибосомой в участке кодон-антикодонового взаимодействия, а может аллостерически ослаблять взаимодействие между рибосомой и тРНК.
Рисунок 1. Химимческая структура Тетрациклина.

Недавно методом рентгеноструктурного анализа (РСА) группами Ноллера  [1] (США) и Рамакришнана [2] (Англия) были получены структуры рибосомы и определены ее функциональные участки. Эти структуры были получены с не достаточно высоким разрешением, минимальное составляло 3.4 А (например: линенйный размер тетрациклина составляет всего 11А). 
    Рамакришнан с сотр. предложили структуру комплекса Тс с малой субчастицей рибосомы Thermus thermiphilus с разрешением 3,4 А. Авторы обнаружили два участка связывания Тс: первый (Tet-1) локализован в районе спиралей Н31 и Н34 16S рРНК и белков S13, S10, S3; второй (Tet-2) локализован в районе спиралей Н11 и Н27 16S рРНК и белка S12. 
Йонат с сотр.[3], используя метод РСА, выявили шесть участков связывания Тс с кристаллом малой субчастицы рибосомы Thermus thermophilus с разрешением 4,5 А.
Маловероятно, что все 6 участков связывания являются функциональными. Согласно известным биохимическим данным таких участков всего 2. 
Задача состоит в исследовании контактов Тс с 30S субчастицей рибосомы Thermus thermophilus. Затем необходимо наложить структуры с тРНК в функциональных участках рибосомы на структуры комплексов с Тс и сделать вывод о возможной функциональной значимости всех участков связывания Тс. Также, из полученных результатов можно предположить механизм действия антибиотика: является ли Тс прямым конкурентным ингибитором связывания тРНК с рибосомой в участке кодон-антикодонового взаимодействия или аллостерически ослабляет взаимодействие между рибосомой и тРНК.
Изучение идентичности окружения всех 6-ти возможных мест связывания тетрациклина к 16S рРНК позволяет сделать предположение о функциональности этих мест. Чем выше средняя идентичность окружения, тем вероятнее, что в этом месте взаимодействие тетрациклина с рРНК специфично, так как тетрациклин малая молекула и возможно, что для полноценного связывания ему необходимо стабильное окружение. 
Возможно, что именно в месте  с наибольшей идентичностью окружения имеет смысл проводить дальнейшие исследования (например, исследования в области фармакологии), т.к., проследив реакцию одного микроорганизма из нижеприведённого списка, мы вполне можем ожидать такой же реакции от другого микроорганизма из той же выборки.       

Материалы и методы.

Первый этап: Изучение ближайшего рибосомального окружения шести молекул тетрациклина.
     На данном этапе работы была использована программа Swiss PDB 
Viewer v3.7b2. [4].
     Было взято окружение на расстоянии 2,5А; 3,0А; 3,5А (с помощью команды “Neighbors of Selected aa”). Затем были описаны контакты всех нуклеотидов, входивших в окружение с молекулами тетрациклина.
 Также с помощью команды “Compute H-bonds” были описаны все теоретически возможные водородные связи между тетрациклинами и рРНК. Для использования данной функции были использованы следующие установки по умолчанию (для тяжёлых атомов без водородов): 
•	Минимальная дистанция: 2.195 А + 0.050 А 
•	Максимальная дистанция: 3.300 А + 0.050 А
•	Угол: 90.000 
Результаты этого этапа работы находятся в разделе “Результаты”.
Второй этап: Поиск важнейших гомологов, рассматриваемой 16S РНК; выравнивание всех найденных последовательностей; поиск консервативных позиций тех нуклеотидов, которые фигурировали в предыдущей части работы в качестве окружения молекул тетрациклина.
     Необходимые гомологи были найдены с помощью интернет-сервера 
“http://srs.ebi.ac.uk” (список найденных организмов см. в разделе “Результаты”). 
Используя программу Alibee (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html), было получено выравнивание последовательностей 16S-рРНК вышеупомянутых гомологов.
Затем с помощью программы GeneDoc Version 2.6.002 полученное выравнивание было визуализированно, и вручную был высчитан процент идентичности необходимых нуклеотидов (см. столбец “идентичность” в нижеследующей таблице).   

Результаты.

1.Список организмов, использованных в исследовании.

AQUIFEX AEOLICUS, AQUIFEX AEOLICUS, AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, ANABAENA SP., BACILLUS HALODURANS, BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS, BACILLUS SUBTILIS, BORRELIA BURGDORFERI, BRUCELLA MELITENSIS, BUCHNERA APHIDICOLA, BUCHNERA APHIDICOLA, CAMPYLOBACTER JEJUNI, CANDIDATUS TREMBLAYA PRINCEPS, CARSONELLA RUDDII, CAULOBACTER CRESCENTUS, CHLAMYDIA MURIDARUM, CHLAMYDIA PNEUMONIAE, CHLOROBIUM TEPIDUM, CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM, CLOSTRIDIUM PERFRINGENS, CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, DEINOCOCCUS RADIODURANS, ESCHERICHIA COLI O6, ESCHERICHIA COLI, EIKENELLA CORRODENS, FUSOBACTERIUM NUCLEATUM, HAEMOPHILUS DUCREYI, HAEMOPHILUS INFLUENZAE, HELICOBACTER PYLORI, LACTOCOCCUS LACTIS, LEPTOSPIRA BIFLEXA, LISTERIA MONOCYTOGENES, MICROCOCCUS LUTEUS, MYCOBACTERIUM BOVIS, MYCOPLASMA GENITALIUM, MYCOBACTERIUM LEPRAE, MYCOPLASMA MYCOIDES, MYCOPLASMA PNEUMONIAE, MYCOPLASMA PULMONIS, MYCOBACTERIUM SMEGMATIS, MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, NEISSERIA MENINGITIDIS, PASTEURELLA MULTOCIDA, PSEUDOMONAS AERUGINOSA, RALSTONIA SOLANACEARUM, RHIZOBIUM LOTI, RHIZOBIUM MELILOTI, RHODOBACTER CAPSULATUS, RICKETTSIA CONORII, RICKETTSIA PROWAZEKII, SALMONELLA TYPHIMURIUM, SPIRULINA PLATENSIS, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STREPTOMYCES COELICOLOR, STREPTOCOCCUS PYOGENES, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS PYOGENES, STREPTOMYCES ROSEOSPORUS, SYNECHOCOCCUS SP., SYNECHOCYSTIS SP., THERMOTOGA MARITIMA, THERMUS THERMOPHILUS, THERMOANAEROBACTER TENGCONGENSIS, THIOBACILLUS CUPRINUS, TREPONEMA PALLIDUM, UREAPLASMA PARVUM, VIBRIO CHOLERAE, XANTHOMONAS AXONOPODIS, XANTHOMONAS CAMPESTRIS, XYLELLA FASTIDIOSA, YERSINIA PESTIS. 

2.Результаты анализа окружения 5ти молекул тетрациклина.

Расстояние	Нуклеотид	Взаимодействие	Расстояние (E)	Вид связи	Идентичность (%)	B-factor	
Тетрациклин №1						
							
2.5	G1035	O10:O1P	2.15	VDW	100	52.13	
	U1177	N21:O1P	2.21	H-bond	95	52.77	
	G1178	N21:O3*	3.31	El.static	97	74.28	
	G1178	O1:O1P	2.66	H-bond	97	74.28	
	G1178	O1:O3*	2.71		97	74.28	
	G1179	O12:O1P	1.99		73	52.30	
	G1179	O1C:O1P	2.59	H-bond	73	52.30	
3.0	MG66					71.20	
3.5	C1036	O11:O1P	3.80		100	66.17	
Тетрациклин №3						
							
2.5	U1141	C62:O2*	2.26	VDW	80	95.76	
	C1144	O6:N4	2.19	VDW	93	140.78	
	G1146	O12:N1	2.46	H-bond	95	134.38	
	G1146	O1C:O6	2.86	H-bond	95	134.38	
	G1146	O1:O6	2.22	H-bond	95	134.38	
	G1146	O12:N2	2.85		95	134.38	
	G1152	O1C:O6	1.92	VDW	86	72.91	
	G1152	C43:O6	2.15	VDW	86	72.91	
	C1153	O11:N4	2.94		86	76.26	
	C1153	O12:N4	2.02	VDW	86	76.26	
3.0	C1143	O6:N4	2.52	H-bond	100	117.69	
	C1145	O1:N4	2.55	H-bond	83	131.94	
	C1145	N21:O2P	4.23	El.static(?)	83	131.94	
	G1154	O12:O6	3.25	H-bond	96	92.84	
	G1154	O11:O6	2.44	H-bond	96	92.84	
	G1154	O11:N7	2.33	H-bond	96	92.84	
	G1154	O10:N7	2.20	H-bond	96	92.84	
	G1155	O6:O6	2.93	H-bond	3	112.89	
3.5	C1147	O1C:N4	3.05	H-bond	92	132.83	
	G1163	C62:N2	3.01		100	113.27	
Тетрациклин №4						
							
2.5	G918	O1:N2	3.24	H-bond	98	61.64	
	G918	O6:N2	1.97	VDW	98	61.64	
	G919	O12:O2*	2.86	H-bond	98	70.97	
	G919	O1:O2*	2.43	H-bond	98	70.97	
	G919	N21:N2	2.43	VDW	98	70.97	
	G1214	C42:O1P	2.77		76	52.41	
	G1214	C43:O2P	2.36	VDW	76	52.41	
	G1324	C62:N2	3.40		93	55.46	
	G1324	O6:N2	3.49		93	55.46	
	A1331	C62:O1P	2.72		99	43.81	
	A1331	C8:O5*	2.22	VDW	99	43.81	
3.0	C1323	N21:N3	3.34		98	59.37	
	C1323	O3:C1*	2.90		98	59.37	
	A1330	C7:O3*	2.62		99	54.25	
	U1332	O10:O1P	2.57		99	52.87	
3.5	U920	O1:O4*	3.24		99	70.94	
	U920	N21:O2	3.32		99	70.94	
	U1213	C43:O3*	3.08		98	47.23	
	U1213	O3:O1P	4.07		98	47.23	
	U1322	N21:O2	4.02		98	52.87	
	U1322	O21:O2*	3.48		98	52.87	
Тетрациклин №5						
							
2.5	U239	C62:O2P	2.36	VDW	100	43.21	
	U239	C9:O2*	2.33	VDW	100	43.21	
	U239	O10:O2*	2.68		100	43.21	
	A241	O11:O1P	2.39	H-bond	99	46.67	
	A241	O12:O2*	2.59	H-bond	99	46.67	
	G871	C7:N2	2.28	VDW	97	66.16	
	G871	C8:N3	2.74		97	66.16	
	G871	O10:O2*	3.31	H-bond(?)	97	66.16	
	G872	O1:O2*	2.69	H-bond	58	46.30	
	G872	O6 1:N3 1	2.27	H-bond	58	46.30	
	C873	N21:O4*	2.41	VDW	61	58.41	
	C873	N21:O2*	2.47	H-bond	61	58.41	
3.0	U882	C62:O2*	2.70		100	42.62	
Тетрациклин №6						
							
2.5	C911	O1C:O2P	2.74	H-bond	98	61.05	
	C911	O12:O1P	2.21	H-bond	98	61.05	
	G1166	C8:O3*	2.09	VDW	75	77.38	
	G1167	C9:O1P	2.39	VDW	100	69.76	
	G1167	C8:O1P	2.37	VDW	100	69.76	
	A1327	O6:O2P	2.47	H-bond	99	39.46	
3.0	G910	C43:O1P	2.64		97	39.24	
	U1326	O11:O1P	3.05		100	48.29	
	U1326	O1:O2*	2.58		100	48.29	
	U1326	O1P:O11	3.05	H-bond	100	48.29	
	U1326	N21:O2*	3.19	H-bond	100	48.29	
	A1359	N21:C2	2.77		99	67.55	
3.5	MG61	O11:MG	3.04			71.20	
H-bonds – водородные связи
VDW – Вандерваальсовы взаимодействия

Обсуждение.

     По имеющимся данным всё окружение Tet2 состоит из белков. В связи с некоторыми расхождениями в описании координат белков не ясно, на каком расстоянии надо искать это окружение. С другой стороны рибосомальные белки являются структурными, т.е. отвечают за правильность структуры рРНК (считается, что рибосома это гигантский рибозим), поэтому возможно, что взаимодействие тетрациклина с белками не функционально. По этим причинам окружение данного тетрациклина не рассматривалось. Тут необходимо более подробное исследование.
     Определённый интерес вызывает процент идентичности нуклеотида G1155 из окружения Tet3 (3%). Возможно, причиной этому послужила неточность в рентгеноструктурном анализе исследуемой 16S рРНК. Это подтверждается и В-фактором (фактором неоднородности нуклеотида в кристалле рРНК). В данном случае он равен 112,89, что является весьма большим показателем. Это говорит о том, что, возможно, этот нуклеотид в кристалле рРНК был в нехарактерном для него положении, ввиду своей высокой подвижности. 
     Так же интересно то, что у окружения Tet3 средний показатель B-фактора 111,05, в то время как у окружения других сайтов он колеблется от 50-ти до 60-ти. Из этого можно заключить, что анализ сайта Tet3 был сделан недостаточно точно, и, следовательно, выводы, сделанные на основании анализа сайта Tet3 не достаточно достоверны.
     Нумерация нуклеотидов была произведена в соответствии с нумерацией исходного pdb-файла, содержащего последовательность 16S-рнк бактерии Thermus Thermophilus. 
     Наибольшее значение В-фактора обнаружено у Tet3 (111,05), далее по убыванию: Tet1 (61,475), Tet6 (59,24), Tet4 (56,53), Tet5 (50,56).
     Наибольшую идентичность проявило окружение тетрациклина №4 (среднее значение консервативности – 95,9%), далее по убыванию: Tet6 (95,4%), Tet1 (93,0%), Tet3 (83,1%), Tet5 (85,8%). 
     По данным исследователей Marta Pioletti etc [3] окружение Tet1 является наиболее функциональным, и, как следствие, предполагается, что его действие на различные организмы предсказуемо и постоянно, а окружение Tet3 для различных организмов не постоянно, что, возможно, говорит о не специфическом взаимодействии тетрациклина с рРНК в этом месте.
    Чтобы более полно рассмотреть структурные основы действия Тс на рибосому следует рассмотреть локализацию функциональных участков на 70S рибосоме. В работе Ноллера с сотр.[1] методом РСА была определена структура комплексов 70S рибосомы Thermus thermophilus с мРНК и тРНК в А-, Р- и Е-участках. В работе Рамакришнана с сотр.[2], были описаны А-, Р- и Е-участки малой субчастицы.
    Накладывая структуры 30S субчастицы с молекулами тРНК и с молекулами Тс друг на друга можно представить расположение антибиотика относительно функциональных участков рибосомы и относительно молекул тРНК.

Выводы.
•	Наиболее идентичным является окружение Tet4, наименее идентичным – Tet5. Возможно, что тетрациклин в сайте Tet4 ввиду высокой идентичности его рибосомального окружения является функционально активным.
•	Окружение Тет3 имеет наименьшую идентичность и самое высокое среднее значение В-фактора. что, возможно, говорит о не специфическом взаимодействии тетрациклина с рРНК в этом месте

 
Список использованной литературы.
[1]	Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H. and Noller, H.F. (2001) Science 292, 883-96.
[2]	Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T. and Ramakrishnan, V. (2000) Nature 407, 327-39.
[3]	Pioletti, M. et al. (2001) Embo J 20, 1829-39.
[4]	Schwede, T., Kopp, J., Guex, N. and Peitsch, M.C. (2003) Nucleic Acids Res 31, 3381-5.