Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

   Факультет биоинженерии и биоинформатики

Проверка обоснованности гипотезы 'Ecdysozoa' на основании филогенетических деревьев рибосомных белков

Курсовая работа

студента 1 курса

И. А. Оловникова

Научный руководитель:
ведущий научный сотрудник
НИИ физ.-хим. биологии
им. А.Н. Белозерского, МГУ
к.б.н. В.В. Алёшин

Аннотация
 
В работе исследуется обоснованность кластирования линяющих животных (Arthropoda, Nematoda и др.), полученного по результатам анализа рибосомальной РНК. В качестве сравнивнительного объекта взяты рибосомальные белки, обладающие высокой консервативностью. Деревья, построенные разными методами для выровненных последовательностей отдельных белков, также как и деревья, построенные по объединенным последовательностям, не показали монофилетичности Ecdysozoa. На результате, вероятно, сильно сказывается скудность сегодняшних баз в отношении избранного маркера.
 
1. Введение

   За несколько столетий существования сравнительной анатомии и морфологии животных, в том числе беспозвоночных, накоплено огромное количество данных, на основании которых построены филогенетические деревья, отражающие возможные пути эволюции организмов от бактерии до человека. Часто некоторые группы объединялись не совсем обоснованно, чему способствовали многочисленные параллелизмы, встречающиеся в морфологии животных, а также  чрезвычайное многообразие жизненных форм в пределах одного истинного таксона. Таким образом, сравнительная анатомия и морфология (а часто и физиология), представив ту модель эволюции, которую мы видим сегодня в учебниках, как представляется, исчерпала свои возможности по установлению реального родства организмов. На помощь приходит молекулярная филогения, позволяющая избежать субъективного фактора, строить деревья видов, основанные на последовательностях тех или иных биологических полимеров, взятых из исследуемых организмов. Естественно, возникает вопрос о том, каким образом, имея такие последовательности , построить филогенетическое древо. К сожалению, эта проблема не разрешена и по сей день. Для исследования ранней дивергенции используют те молекулы, которые меньше других подвергаются быстрым эволюционным изменениям (то есть наиболее консервативные молекулы). Консервативны они потому, что несут жизненно важные функции; малейшее изменение в структуре молекулы может повести за собой необратимые последствия, и организм с этой дефектной молекулой погибнет. Но природа допускает небольшой люфт даже при построении таких молекул: все-таки возможны постепенные изменения их последовательностей с появлением компенсаторных изменений в других молекулах (или, как это ни странно, той же самой молекуле). Благодаря такому люфту мы и можем проследить эволюционный ряд: если в каком-то организме появилось изменение, которое присутствует у всех  его потомков (синапоморфия), мы можем это явление изобразить на кладограмме узлом. В дальнейшем вновь может произойти какое-то небольшое изменение в одной из двух образовавшихся ветвей, и его мы опять же отметим узлом и т. д.
   Одной из первых и самых перспективных исследуемых консервативных молекул стала рибосомальная РНК (рРНК), образующая «скелет» рибосомы [Pechman, Woese  1972]. С помощью нее были построены новые деревья видов, которые во многом сильно отличались от «классических» деревьев. Одной из недавних сенсаций, сделанных на основе сравнения последовательностей рибосомальной РНК беспозвоночных животных, стало обнаружение существенного сходства этой рРНК у таких разных групп как круглые  черви, членистоногие, тихоходки, приапулиды и др. [Aguinaldo et al. 1997]. Интересно, что всех их объединяет линька, и поэтому объединенный таксон (неясного ранга) назвали ”Ecdysozoa”, т.е. ”линяющие животные” (молекулярная филогения здесь непосредственно граничит с морфолого-анатомической!). Это открытие повлекло за собой большой поток исследовательских работ. Одни данные подтверждают родство этих групп [Crossgrove K et al. 2002 ; Haase A et al. 2001 и др.], другие, наоборот, опровергают его, указывая на искусственность филогенетического метода, применяемого авторами гипотезы [см.напр. Jaime E. Blair et al. 2002]. На самом деле, действительно, существуют некоторые не молекулярно-филогенетические предпосылки к объединению линяющих групп. Например, давно уже показано, что линяющие животные лишены эктодермальной цилиатуры. В то же время планктотрофные личинки представителей группы Lophotrochozoa, противопоставляемой теперь Ecdysozoa, имеют мерцательную выстилку кишечника, с помощью которой они прогоняют сквозь себя воду с пищей; у личинок же Ecdysozoa планктотрофные личинки на ранних стадиях онтогенеза приобретают конечности, которые выполняют аналогичную функцию. Также в некоторых физиологических экспериментах (см.напр. Crossgrove K et al. 2002) показано, что введение гормонов, участвующих в подготовке к линьке, самой линьке или определенных стадиях метаморфоза насекомого, могут индуцировать сбрасывание ларвальных покровов нематоды. Существуют, однако, немертины. Их планктонная личинка (пилидий), обильно покрытая ресничками, к конечной стадии развития сбрасывает покровы, из которых выходит молодое животное. Линька пилидиев, возможно, и не имеет общего с линькой Ecdysozoa, зато показывает, какое поразительное сходство может возникнуть в результате конвергенции, и заставляет задуматься о справедливости принятых многими авторами по умолчанию гипотезах, таких, как например, гипотеза Deuterostomia-Lophotrochozoa-Ecdysozoa.  
   В настоящей работе поставлена задача предварительного исследования этого феномена с помощью других молекул, а именно рибосомальных белков [Wolf et al. 2001]. Они выбраны потому, что несмотря на непосредственное  взаимодействие с рРНК, они эволюционируют в большой степени независимо от нее, и это позволит проверить полученный ранее неожиданный результат с помощью абсолютно иного и нового филогенетического маркера. Многие из этих белков (а их известно несколько десятков) соответствуют всем устоявшимся на сегодняшний день представлениям о консервативности и постепенной нейтральной или прогрессивной эволюции. Задача работы состоит в отборе белков с наибольшей таксономической представленностью в доступных сегодня базах данных, их выравнивании и построении максимально реалистичных (математически) деревьев.
    
2. Материалы и методы
2.1. Электронные базы данных и поиск по ним

Для поиска первичных структур рибосомальных белков использовались ресурсы “Entrez-protein” NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein ), The Institute of Genomic Research (http://tigrblast.tigr.org/euk-blast/index.cgi?project=sma1), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml ), базы данных по паразитическим организмам (http://www.ebi.ac.uk/blast2/parasites.html), EBI Sequence Retrieval System ( http://srs.ebi.ac.uk/ ), Nematode Net (http://www.nematode.net/ ), BlaxterLab Nematode Blast Server (http://nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html)  и некоторые другие. Поиск проводили по ключевым словам, а в тех базах, где предусмотрен поиск по первичным структурам макромолекул, использовали программу BLAST [Altschul et al., 1997] или WU-BLAST [Gish, States, 1993]. 

2.2. Анализ кДНК

Для некоторых белков, отсутствующих в базах белковых последовательностей, использовали базы кДНК. Найденные нуклеотидные последовательности транслировали программой ExPASy Translation tool(http://us.expasy.org/tools/dna.html), а нужную рамку трансляции отбирали с помощью программы DotHelix пакета EMBOSS (http://www.belozersky.msu.ru/services/ dhm/advanced.html ), которая строит карту локального сходства двух последовательностей. Суммарные последовательности некоторых рибосомных белков были составлены по последователь- ностям нескольких клонов кДНК, извлеченных из соответствующих баз.

2.3. Форматы записи

Отобранные последовательности переводили в FASTA формат и сохраняли в соответствующем файле. Для каждого белка был создан отдельный файл, каждая запись в котором содержит ID последовательности в одной из указанных баз, название организма и саму последовательность. Также для удобства работы с программой визуализации деревьев каждый файл был сохранен еще и без ID записей (которые сильно загромождают рисунок при выводе построенного дерева).

2.4. Выравнивание последовательностей

С помощью программы ClustalW 1.83 (Thompson et el., 1994) отобранные последовательности были выровнены, и построены предварительные деревья (все параметры принима- лись по умолчанию). Файл с выравниванием ( расши- рение “.aln”) переводил ся в формат PHYLIP программой FORCON (Raes, J. and Van de Peer,Y. (1999),http://vulcan.rug.ac.be/~jerae/ForCon/). Полученное выравнивание редактировали вручную с помощью программы GeneDoc 2.6.002(Nicholas et al., 1997,http://www. psc.edu/biomed/genedoc/): отбрасывали посторон- ние случайные (и искали истинные) или повторен-ные несколько раз после довательности, удаляли лишние а.о., полученные при трансляции нуклеотид ных последовательностей и т.д.

2.5. Филогенетический анализ

   Дистанционные деревья построены программой neighbor после вычисле- ния дистанций с помощью protdist пакета PHYLIP (Felsenstein, 1993). Для вычисления попарных дистанций использовали модель замещений JTT или BLOSUM62 без гамма коррекции или с гамма коррекцией. Значение альфа параметра гамма распределения вычисляли программой  TREE-PUZZLE 5.0 (Strimmer, von Haeseler, 1996) для 8 категорий скорости аминокислотных замещений. Максимально экономные деревья были построены программой protpars пакета PHYLIP. Статистическую надежность узлов дерева оценивали с помощью процедуры ресэмплинга. Для этого программой seqboot (пакет PHYLIP) генерировали 100 наборов с помощью процедуры полувырезания (jackknife), которые анализировали как описано выше. Результирующее дерево строили программой consense. Максимально правдоподобные деревья строили программами TREE-PUZZLE 5.0 и MrBayes 3.0b4 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001) при различных моделях аминокислотных замещений. Для отображения деревьев использовали программу “TreeView (Win32)” (Page, 1996). 

3. Результаты
3.1. Поиск рибосомных белков в базах данных 

На первом этапе были исследованы базы данных SWISSPROT, Sp TrEMBL,TrEMBL (updates), а также некоторых баз (PIR, PRF и др.), стоящих по умолчанию в некоторых поисковых сайтах. Для отбора белков, последовательности которых имеются для максимального числа видов из интересующих таксонов (в том числе разной степени родства к Ecdysozoa- так называемых, внешних групп, от количества которых в огромной степени зависит качество построенного дерева), была построена таблица в программе Excel, содержащая большинство рибосомальных белков как маленькой, так и большой субъединиц. В таблице также показаны конкретные виды (с помощью функции “Insert comment”). В дальнейшем она была сильно изменена (Табл. 1).
Оказалось, что почти ни в каких базах нет данных о рибосомальных белках малой субъединицы для группы Lophotrochozoa ( Annelida, Mollusca, Platyhelminthes?, Lophophorata, Nemertini, Entoprocta, Bryozoa?). В настоящее время не секвенировано ни одного полного генома из этой группы , а BLAST ни для одного частичного генома (даже брюхоногого моллюска Aplysia, самого продвинутого в этом отношении организма, в связи с активным изучением его нервной системы) нами не обнаружен. Найдены лишь последовательности (иногда частичные) белков S2, S24, S27 для земляного червя Lumbricus rubellus (Annelida), а так же последовательности всех выбран- ных нами для этого исследования белков (кроме S24) для тех или иных моллюсков (Aplysia californica, Chlamys farreri,   Argopecten irradians). 
В итоге было извлечено около двухсот последовательностей, из которых отобрали примерно 170. Многие из последовательнос- тей, принадлежащих таксонам, важным для разрешения вопроса о родственных связях Ecdysozoa, оказались частичными, что, возможно, сильно сказывается на разультатах филогенетического анализа, описываемого ниже. 
	Среди последовательностей рибосомальных белков, найденных как по ключевым словам, так и с помощью BLAST, при последующем анализе были обнаружены последовательности, мало сходные с белками соответствующих семейств. Они были исключены из филогенетического анализа. 

      3.2. Филогенетический анализ последовательностей
отдельных рибосомных белков
Несмотря на относительную простоту алгоритма программы neighbor (метод neighbor joining - связывание ближайших соседей), он показал гораздо лучшие результаты (в той или иной мере сходные с традиционными представлениями о родстве групп), нежели более чувствительная к нехватке участков каких-то белков в выравнивании программа protpars или, например, TREE PUZZLE 5.0, который коллапсирует узлы, поддержаные менее 50% паззлинга. Чаще всего последняя выводила дерево в виде “гребенки”, что и следовало ожидать при такой малой подборке, как у нас. Ниже приведены несколько деревьев, построенные методом связывания ближайших соседей (Neighbor Joining). Серым цветом выделены группы, относящиеся, по Aguinaldo с соавт. (1997), к кластеру Ecdysozoa. Хорошо видно, что ни на одном из них Ecdysozoa не объединены. На многих из полученных деревьев многоклеточные животные и грибы оказываются ближайшими   соседями (см., например, рис. 1, 2). Среди животных, как в классических учебниках, целомические животные и первично полостные стоят порознь (рис. 1). Как объект для тщательной обработ- ки филогенетичес- кими программами, был выбран белок S2, в основном   благодаря своей наибольшей длине из подборки.Программам на вход подавалось выравнивание, из которого вручную удалили начальный вариабельный учас- ток длиной около 30 а.о. Топология дерева сильно зависела от алгорит ма построения, предполагаемой модели молекулярной эволюции (JTT или BLOSUM62), парамет- ров, в том числе параметра альфа гамма распределе ния.

    При внесении, помимо значения гамма коррекции, параметров скорос- тей, вычисленных программой TREE-PUZZLE 5.0, тополо- гия также сущест- венно изменилась. Здесь не приводятся
полученные деревья, так как их структура очень разнообразна, возможно, в связи с неполнотой последовательностей, а может быть, и неправильностей самих последовательностей (менее чувствительные программы этого не «заметили»?). 

3.3. Филогенетический анализ объединенных рибосомных белков

     Были также составлены объединенные выравнивания нескольких белков (разные комбинации) и построены максимально правдоподобные деревья программой TREE-PUZZLE , используя алгоритм  квартет-паззлинга (с числом «шагов» 1000) при модели замещений JTT. Наиболее достоверные деревья должны получаться при максимально возможной длине выравнивания, поэтому тем же методом было построено дерево на основе объединенного выравнивания шести отобранных белков (S2, S24, S27, S6, S14 и S8). Общая длина объединенного выравнивания была 1137 а.о. Как и в предыдущих случаях, на полученном дереве очень сильно сказалась неполнота отдельных последовательностей (см. Neurospora и Trichinella на рис. 4). На нем, как и во многих предыдущих деревьях, целомические животные (насекомые и позвоночные) отделены от первичнополостных (Nematoda) и, в соответствии с этим Ecdysozoa не кластируется.

	Лучшие резуль- таты по обработке объединенного вырав нивания показала программа MrBayes 3.0, уже заслужив шая славу одной из наиболее удачных среди филогенети- ческих программ. На дереве (рис. 5) вид ны все тенденции, характерные для NJ деревьев. На всех комбинированных выравниваниях (а, следственно, и на деревьях) сказалось то, что при их создании пришлось удалять некоторые виды в связи с    отсутствием необ- ходимых последова- тельностей для каждого белка (см. табл.1, на которой показаны результаты поиска рибосомаль- ных белков по различным базам).

Табл.1 Сводная таблица использумых в работе белков/ организмов. Зачернены последовательности, которые не удалось найти. В столбце видов выделены особо интересующие группы, полужирным шрифтом отмечены линяющие животные.

	S14	S2	S24	S27	S6	S8	
Saccharomyces	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Schizosaccharomyces	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Neurospora	       *	big fragm	       *	       *	       *	       *	
Phytophthora	 	       *	 	       *	       *	       *	
Guillardia	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Trypanosoma	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Plasmodium	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Leishmania	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Entamoeba	       *	       *	fragm 	       *	       *	       *	
Staphylococcus	       *	       *	 	 	 	       *	
Dictyostelium	       *	       *	       *	       *	fragm 	       *	
Caenorhabditis	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Ascaris	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Brugia	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Dirofilaria	fragm	 	 	 	 	 	
Heterodera	       *	BAD	BAD	BAD	 	       *	
Trichinella 	       *	fragm	big fragm	 	big fragm	       *	
Toxocara	       *	 	       *	       *	       *	       *	
Anopheles	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Drosophila	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Manduca	 	 	       	 	       *	 	
Spodoptera	       *	       *	       *	       *	       *	       *	
Penaeus	       *	       *	       *	       *	 	       *	
Lumbricus	 	       *	       *	       *	 	 	
Urechis	 	       *	 	 	 	 	
Argopecten	 	 	 	       *	 	       *	
Chlamys	fragm	       *	 	       *	fragm	Fragm	
Aplysia	 	 	 	 	       *	 	
Ictalurus	      *	       *	       *	       *	       *	       *	
Homo	     *	       *	       *	       *	       *	       *	
Xenopus	 	 	 	       *	       *	 	
Branchiostoma	 	       *	 	       *	       *	 	
Takifugu	 	 	       *	 	 	 	
Paracentrotus	 	 	       *	 	       *	 	
Strongylocentrotus	 	 	       *	 	       *	 	
Podocoryne	       *	 	 	 	 	 	
Echinococcus	       *	 	       *	 	       *	       *	
Clonorchis	 	 	       *	 	 	 	
Schistosoma	       *	       *	       *	       *	       *	       *	

Рис. 4. Дерево, построенное программой TREE-PUZZLE по объединенному выравниванию шести рибосомальных белков малой субъединицы. Числа показывают процент паззлингов, поддерживающих соответствующий узел.

10

Рис. 5. Дерево, построенное программой MrBayes по объединенному выравниванию шести рибосомальных белков малой субъединицы.

  

                           Выводы

1.	В доступных базах данных последовательности рибосомных белков Lophotrochozoa представлены намного менее полно, чем соответствующие последовательности Ecdysozoa.
2.	Белки изученных семейств проявляют неодинаковую эволюционную консервативность в различных филогенети- ческих линиях, что выражается в отличиях длин ветвей на дистанционных деревьях.
3.	Топология деревьев, построенных по последовательностям отдельных белков или объединенным последовательностям шести рибосомных белков, сильно зависит от алгоритма построения и параметров, таким образом, не позволяет сделать обоснованного вывода о филогенетических отношениях изучаемых групп.

                         Литература

  1) Алешин В.В., Петров Н.Б.  Молекулярные свидетельства регресса в эволюции многоклеточных животных. // Журн. общ. биол. 2002.- Т.63. №3.- с.3-16
  
  2)  Вьюгин В.В., Гельфанд М.С., Любецкий В.А. Согласование деревьев: реконструкция эволюции видов по филогенетическим деревьям генов. Мол. биол. 2002.- Т.36. №5.- с.807-816

  3)  Петров Н.Б., Алешин В.В. Условно-нейтральные филогенетические признаки крупных таксонов - новый аспект эволюции макромолекул. Генетика. 2002.- Т.38. №8.- с.1043-1062
    
  4)  Aguinaldo A.M., Turbeville J.M., Linford L.S., Rivera M.C., Garey J.R., Raff R.A., Lake J.A. Evidence for a clade of nematodes, arthropods and other moulting animals. Nature. 1997. V. 387(6632):489-493.
 
  5)  Crossgrove K, Laudet V, Maina C.V. Dirofilaria immitis encodes Di-nhr-7, a putative orthologue of the Drosophila ecdysone-regulated E78 gene. Mol Biochem Parasitol. 2002 Feb;119(2):169-77.

  6)  Haase A, Stern M, Wachtler K, Bicker G. A tissue-specific marker of Ecdysozoa. Dev Genes Evol. 2001 Sep;211(8-9):428-33.

  7)  Blair JE, Ikeo K, Gojobori T, Hedges SB. The evolutionary position of nematodes. BMC Evol Biol. 2002 Apr 8;2(1):7. Epub 2002 Apr 08

  8) Aleshin VV, Milyutina IA, Kedrova OS, Vladychenskaya NS, Petrov NB. Phylogeny of Nematoda and Cephalorhyncha derived from 18S rDNA. J Mol Evol. 1998. 47(5):597-605

  9) Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. 25. P. 3389-3402.

  10) Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Distributed by the author. Seattle: Department of Genetics, University of Washington, 1993.

  11) Gish W, States D.J. Identification of protein coding regions by database similarity search // Nature Genetics. 1993. 3. P. 266-272.

  12) Huelsenbeck J.P., Ronquist F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees // Bioinformatics. 2001. 17, 754-755.

  13) Lecompte O, Ripp R, Thierry JC, Moras D, Poch O. Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale. Nucleic Acids Res. 2002 Dec 15;30(24):5382-90.

  14) Manuel M, Kruse M, Muller WE, Le Parco Y.   The comparison of beta-   thymosin homologues among metazoa supports an arthropod-nematode clade. J Mol Evol. 2000. 51(4):378-81

  15) Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., and Deerfield, D.W. II. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS 4:14.

  16) Page, R. D. M. 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers // Computer Applications in the Biosciences 12: 357-358. 

  17) Pechman K.J., Woese C.R. Characterization of the primary structural homology between the 16s ribosomal RNAs of Escherichia coli and Bacillus megaterium by oligomer cataloging.
J. Mol. Evol. 1972. V. 1(3):230-40.
 
  18) Raes, J. and Van de Peer,Y. (1999) ForCon : a software tool for the conversion of sequence alignments // EMBnet.news 6(1).

  19) Strimmer K., von Haeseler A. Quartet puzzling: a quartet maximum likelihood method for reconstructing tree topologies // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. № 2. P. 964-969.

  20) Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22(22). P. 4673-4680.
  21) Wolf Y.I., Rogozin I.B., Grishin N.V., Tatusov R.L., Koonin E.V. Genome trees constructed using five different approaches suggest new major bacterial clades // BMC Evol. Biol. 2001. V. 1(1):8.