Московский Государственный Университет 
им. М. В. Ломоносова.

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Поляков Никита Михайлович

Анализ зоны контакта рибосомального белка S7 эубактерий и 16S рРНК 

Курсовая работа

              
                                                
Научный руководитель:
М.н.с., к.х.н. Головин А. В.

Москва
2003 г.

Содержание.
Содержание	1	
Аннотация	2	
Введение	2	
Материалы и методы		
•	Определение области контакта рибосомального белка S7 с 16S рРНК в структуре Tth30S.	5	
•	Исследование консервативности контактирующих аминокислотных остатков в S7 и рибонуклеиновых оснований 16S рРНК у эубактерий	6	
•	Моделирование структуры EcoS7.	9	
•	Оптимизация структуры белка EcoS7 в комплексе с 16S рРНК	10	
Результаты и обсуждение	13	
Выводы	16	
Список литературы	17	

Аннотация.
Сборка бактериальных рибосом состоит в поэтапном взаимодействии рибосомных белков с рРНК. Биогенез рибосом является очень затратным процессом для клетки, что требует точной регуляции. На этапе координации синтеза рибосомальных белков и рРНК регуляция определяется высоко специфичными альтернативными взаимодействиями рибосомальных белков либо с рРНК, либо с собственной мРНК. Такие РНК - белковые взаимодействия являются критическими для прокариотической клетки и прямо влияют на динамику ее роста. Для формирования цельной картины, отражающей процесс сборки рибосом, важны не только структурные исследования, которые интенсивно развиваются в последнее время, но и разработка термодинамических подходов.
Работа посвящена начальному этапу изучения взаимодействия фрагмента 16S рРНК с белком S7 -ключевым белком сборки малой субчастицы прокариотических рибосом. 

Введение.
Достигнутые в последние два года фантастические успехи рентгеноструктурного анализа (РСА) по расшифровке структуры 30S субчастицы [1] и 70S рибосом [2] бактериальных рибосом, 70S рибосомы и ее функциональных комплексов с мРНК и тРНК выдвигают на первый план цели, связанные с детальным изучением динамических процессов, в которых участвует рибосома. Кроме цикла трансляции, к таким процессам относится сборка рибосомы, которая является очень затратным процессом для клетки и прямо связана с динамикой ее роста. Для понимания сборки рибосомы важна не только структура взаимодействующих макромолекул и их комплексов, но и изучение термодинамики их взаимодействия. Этому аспекту, в отличие от структурных работ, уделяют мало внимания.
Бактериальная рибосома представляет собой очень сложный рибонуклеопротеидный комплекс, состоящий из 50 различных белков небольшого размера и трех рРНК размерами около 120, 1500 и 3000 нуклеотидов. Один из подходов к изучению рибосомы состоит в выявлении автономности и моделировании структуры отдельных доменов или даже отдельных фрагментов субчастиц. К последним относятся комплексы индивидуальных белков с фрагментами рРНК. Именно такие бинарные взаимодействия определяют первые этапы сборки рибосомы, в то время как структура соответствующего РНП в составе рибосомы отражает уже конечный продукт сборки.
Одним из четырех основных элементов структуры малой субчастицы бактериальных рибосом является З'-концевой домен 16S рРНК [3], основу которого составляет рРНК-белковый комплекс с рибосомным белком S7. Белок S7 прокариот играет ключевую роль в биогенезе рибосом. Как основной структурный компонент малой субчастицы, S7 является одним из двух белков (кроме S4), который инициирует ее сборку. При этом он связывается с З'-концевым доменом 16S рРНК и стимулирует взаимодействие других белков, формируя З'-концевой рибонуклеопротеидный домен. При отсутствии синтеза 16S рРНК, как белок-репрессор, он аутогенно регулирует свой синтез, связываясь с собственной матрицей, str мРНК, что ингибирует ее трансляцию. Этот процесс прямо связан с динамикой роста бактериальной клетки.
S7 - это относительно небольшой белок, состоящий примерно из 150 аминокислот. Интересной особенностью первичной структуры S7 является вариабельность N-концевых последовательностей. Трехмерная структура S7 была получена методом РСА для двух термофильных белков - TthS7 (Thermus thermophilus) и BstS7 (Bacillus stearothermophilus) [4,5]. Для выяснения функции отдельных аминокислот и элементов структуры белка в последние два года начаты работы по направленному мутагенезу белка BstS7 in vitro и EcoS7 (Escherichia coli) in vivo.
Кроме того, появились данные РСА о структуре высокого разрешения малой субчастицы бактериальных рибосом Т. thermophilus (Tth30S), из которых можно вычленить и проанализировать структуру 16S РНК - белкового комплекса для S7. Еще раз подчеркнем, что именно на этот вопрос (и только на него) – какова структура конечного продукта рРНК - белкового взаимодействия - дает ответ современное моделирование структуры рибосом.
Изучение взаимодействия индивидуального белка S7 с 16S рРНК особенно интересно, поскольку оно определяет первый этап сборки малой субчастицы рибосом. Трудность в изучении таких взаимодействий связана с большими размерами 16S рРНК, длинна которой составляет 1542 нуклеотида. Для детального изучения взаимодействия S7 с 16S рРНК методами молекулярной динамики требуется минимизировать фрагмент 16S рРНК, способный к специфическому взаимодействию с белком S7. С помощью метода химической модификации Ноллер с сотр.[6] картировал участок связывания S7 на 16S рРНК. Делеционный анализ участка связывания S7 на 16S рРНК, выполненный Браки-Жингра [3] с сотр., позволил сократить узнаваемый фрагмент 16S рРНК до сотни нуклеотидов. 
Компьютерное моделирование третичной структуры белка EcoS7 позволяет ответить на следующий вопрос – как использовать данные, полученные РСА для термофильных рибосом, для рибосом E.coli. Эксперименты in silico были призваны выяснить возможность решения следующей дилеммы: все существующие на сегодня  биохимические и генетические данные получены, в основном, для  клеток E. coli, а структурные данные имеются для рибосом T. thermophilus. Отсутствие гомологий в первичных структурах между рибосомными компонентами в ряде случаев достаточно ощутимо, что не позволяет проводить прямую экстраполяцию данных. Одним из путей решения дилеммы для изучения РНК-белкового узнавания может быть возможность замены мезофильного на термофильный белок, и обратно, в комплексах с РНК E. coli.
На сегодняшнем этапе выясняется, что именно те аминокислотные остатки и нуклеиновые основания консервативны, которые образуют интересующие нас связи.  

Материалы и методы.
Определение области контакта рибосомального белка S7 c 16S рРНК в структуре Tth30S.
Первым этапом работы было определение области контакта рибосомального белка S7 c 16S рРНК в структуре Tth30S, используя Swiss-PDBViewer 3.7. 
Далее было проведено компьютерное аннотационное описание зоны контакта белка TthS7 с Tth16S рРНК  в структуре Tth30S по данным РСА Рамакришнана и сотр. Зону РНК-белковых контактов анализировали с помощью программы Swiss PDB Viewer [7], выявляя аминокислоты TthS7, удаленные от Т. thermophilus 16S рРНК на расстоянии 3,5 Å и выясняя возможность образования РНК-белковых межмолекулярных взаимодействий.
Результаты анализа приведены в таблице.

Аннотационное описание зоны контакта белка TthS7 с Tth16S рРНК  в структуре Tth30S субчастицы рибосомы.

Амино к-та	НК	атом НК	атом а. к.	Тип взаимодействия	Длина связи	
Ala2	G1379	N7	O	Элекростатические взаимодяйствие	3,49	
	G1379	O6	N	Водородные связи	3,11	
Arg3	U1380	O4	N	Элекростатические взаимодяйствие	3,07	
	U1380	O2	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,50	
	C932	C4	CZ	Гидрофобные взаимодействия	3,23	
	G933	N7	NE	Водородные связи	2,68	
	G933	O6	NH2	Водородные связи	2,58	
Arg4	A G933	O1P	NE	Водородные связи	2,86	
	A1092	O3*	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,34	
Arg6	C1378	O1P	O	Элекростатические взаимодяйствие	3,48	
	G1379	O2P	NE	Водородные связи	3,14	
Ala7	C1378	O1P	O	Элекростатические взаимодяйствие	3,40	
Arg10	U1376	O4	NE	Водородные связи	3,01	
Asn28	A1374	O2*	O	Элекростатические взаимодяйствие	3,42	
	A1375	O1P	ND2	Элекростатические взаимодяйствие	3,25	
Lys29	C940	O1P	NZ	Водородные связи	2,73	
	A1375	O2*	NZ	Водородные связи	3,14	
Ile30	U1240	N3	O	Элекростатические взаимодяйствие	2,87	
Arg32	U1240	O2*	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,38	
	U1240	O4	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,45	
Asp33	A1350	O2*	OD1	Водородные связи	2,85	
Gly34	U1372	O2*	O	Водородные связи	2,79	
Lys35	G1241	O1P	NZ	Водородные связи	2,68	
	G1290	O1P	NZ	Водородные связи	2,70	
Lys36	A1374	O1P	NZ	Водородные связи	2,72	
Asn37	G1291	O1P	OD1	Водородные связи	3,02	
Arg41	G1291	O1P	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	2,89	
	G1291	O1P	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,45	
	G1291	O3*	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	2,78	
	U1292	O1P	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,35	
	U1292	O2P	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,26	
Arg76	C1378	O2	NH1	Водородные связи	3,17	
Gly81	G693	O2*	O	Водородные связи	3,06	
Arg94	U1376	O2P	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,21	
	A1377	O2P	NE	Элекростатические взаимодяйствие	3,22	
	A1377	O2P	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,22	
Arg95	A938	O3*	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,41	
	G939	O1P	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,22	
	G939	O1P	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,39	
G Ser98	U1376	O1P	OG	Водородные связи	2,78	
Arg102	G939	O1P	NH1	Водородные связи	3,09	
	C940	O1P	NE	Водородные связи	2,75	
Asn109	U1240	O4	ND2	Водородные связи	3,09	
Arg114	A1239	O2*	O	Водородные связи	2,63	
	C1297	O3*	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,44	
	C1298	O2P	NH2	Водородные связи	2,78	
	C1298	O5*	NH2	Элекростатические взаимодяйствие	3,40	
	C1298	O2*	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,10	
Ala116	U1240	O2P	N	Водородные связи	2,66	
Arg119	U1240	O1P	NH2	Водородные связи	2,89	
	U1240	O1P	NH1	Элекростатические взаимодяйствие	3,48	

Исследование консервативности контактирующих аминокислотных остатков в S7 и рибонуклеиновых оснований 16S рРНК у эубактерий.
Для определения консервативности контактирующих аминокислотных остатков в S7 и рибонуклеиновых оснований 16S рРНК у эубактерий проводиться поиск через систему SRS расположенную на сайте www.srs.ebi.ac.uk последовательностей белков S7 и 16S рРНК всех бактерий, последовательность белка S7 которых известна. Было найдено семьдесят бактерий, приведенный ниже:
AQUIFEX AEOLICUS, AQUIFEX AEOLICUS, AGROBACTERIUM TUMEFACIENS, ANABAENA SP., BACILLUS HALODURANS, BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS, BACILLUS SUBTILIS, BORRELIA BURGDORFERI, BRUCELLA MELITENSIS, BUCHNERA APHIDICOLA, BUCHNERA APHIDICOLA, CAMPYLOBACTER JEJUNI, CANDIDATUS TREMBLAYA PRINCEPS, CARSONELLA RUDDII, CAULOBACTER CRESCENTUS, CHLAMYDIA MURIDARUM, CHLAMYDIA PNEUMONIAE, CHLOROBIUM TEPIDUM, CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM, CLOSTRIDIUM PERFRINGENS, CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, DEINOCOCCUS RADIODURANS, ESCHERICHIA COLI O6, ESCHERICHIA COLI, EIKENELLA CORRODENS, FUSOBACTERIUM NUCLEATUM, HAEMOPHILUS DUCREYI, HAEMOPHILUS INFLUENZAE, HELICOBACTER PYLORI, LACTOCOCCUS LACTIS, LEPTOSPIRA BIFLEXA, LISTERIA MONOCYTOGENES, MICROCOCCUS LUTEUS, MYCOBACTERIUM BOVIS, MYCOPLASMA GENITALIUM, MYCOBACTERIUM LEPRAE, MYCOPLASMA MYCOIDES, MYCOPLASMA PNEUMONIAE, MYCOPLASMA PULMONIS, MYCOBACTERIUM SMEGMATIS, MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, NEISSERIA MENINGITIDIS, PASTEURELLA MULTOCIDA, PSEUDOMONAS AERUGINOSA, RALSTONIA SOLANACEARUM, RHIZOBIUM LOTI, RHIZOBIUM MELILOTI, RHODOBACTER CAPSULATUS, RICKETTSIA CONORII, RICKETTSIA PROWAZEKII, SALMONELLA TYPHIMURIUM, SPIRULINA PLATENSIS, STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STREPTOMYCES COELICOLOR, STREPTOCOCCUS PYOGENES, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS PYOGENES, STREPTOMYCES ROSEOSPORUS, SYNECHOCOCCUS SP., SYNECHOCYSTIS SP., THERMOTOGA MARITIMA, THERMUS THERMOPHILUS, THERMOANAEROBACTER TENGCONGENSIS, THIOBACILLUS CUPRINUS, TREPONEMA PALLIDUM, UREAPLASMA PARVUM, VIBRIO CHOLERAE, XANTHOMONAS AXONOPODIS, XANTHOMONAS CAMPESTRIS, XYLELLA FASTIDIOSA, YERSINIA PESTIS. 
Для выравнивания, с целью выявления консервативности используем программу NСlustalW, затем в ручную считаем консервативность (как отношение количества мономера Thermus thermophilus , или равносильных ему, к общему количеству мономеров в выравненом столбце, в %). 

Консервативность контактирующих с 16S РНК аминокислотных остатков белка S7.

Аминокислота в Thermus thermofilus	Сколько раз встречается	Консервативность	Другие аминокислоты в столбце	Консервативность     
 (с учетом равносильной замены)	
Ala2	3	3.90%	P34S27M10–1R1G1	3.90%	
Arg3	74	96.10%	–1A1S1	96.10%	
Arg4	39	50.65%	K35G2–1	(R.K) 96.10%	
Arg6	12	15.58%	P15S11V10K7A7E3H3I3G2–1	(R.K)4.68%	
Ala7	38	49.35%	V15I12T3P2S1Y1K1N1–1	49.35%	
Arg10	67	87.01%	K3–2L1T1G1Q1A1	(R.K) 92.21%	
Asn28	70	90.91%	R3–2K1S1C1A1	90.91%	
Lys29	22	28.57%	R10V9I6A4N4M3T3H1C1S1–1	(R.K) 41.56%	
Ile30	25	32.47%	V28L17M4–2E1	(I.L.V) 90.91%	
Arg32	5	6.49%	L12V15K8I6Y5E4Q2W2N2–2D1F1M1	(R.K) 16.88%	
Asp33	46	59.74%	S9H8E3A2N2K2G2–2T1	59.74%	
Asn37	3	3.90%	S47G15A5N3T2–2L1Q1V1	3.90%	
Arg41	24	31.17%	K19S14T5A3N3G2V2W2–2I1	(R.K) 55.84%	
Arg76	34	44.16%	K37T2–2S1V1	(R.K) 92.21%	
Arg94	7	9.09%	E24D12S10V9A3G3Q2K2–2T1P1	(R.K) 11.69%	
Arg95	75	96.10%	–2S1	96.10%	
Asn109	3	3.90%	R58K4D3S2Q2–2L1A1M1	3.90%	
Arg114	14	18.18%	K40N7H5T5Y3–2Q1	(R.K) 70.13%	
Arg119	45	50.65%	K25G3–2L1C1	(R.K) 90.91%	
Среднее	31.89	40.94%		50.49%	
За вычетом Ala2 считая исходными Arg109 и Ser47	38.52941176	49.50%		78.79%	

По сравнению с общей консервативностью аминокислотных остатков в белке S7, консервативность контактирующих аминокислотных остатков вполне высока (78.79%). 

Консервативность контактирующих с белком S7 нуклеотидов 16S РНК.
Нуклеотид в Thermus thermophilus	Сколько раз встречаеться в столбце	Консервативность	Другие Нуклеотиды в столбце	
G693	77	71.96%	–12T10A8	
C932	103	96.26%	G1N1–2	
G933	104	97.20%	A1C1–1	
A935	105	98.13%	R1–1	
A938	107	100.00%		
G939	107	100.00%		
C940	99	92.52%	T7–1	
A1092	103	96.26%	N4	
A1239	107	100.00%		
U1240	107	100.00%		
G1241	107	100.00%		
G1290	33	30.84%	A43C23T5–3	
G1291	32	29.91%	C49T26	
U1292	16	14.95%	C42G29A19–1	
C1297	61	57.01%	T41A5	
C1298	105	98.13%	T1N1	
A1346	106	99.07%	G1	
A1350	106	99.07%	G1	
U1372	106	99.07%	G1	
G1373	105	98.13%	N2A1	
A1374	107	100.00%		
A1375	106	99.07%	G1	
U1376	105	98.13%	–1C1	
A1377	106	99.07%	–1	
C1378	104	97.20%	–2G1	
G1379	105	98.13%	A1–1	
U1380	106	99.07%	–1	
Среднее	94	88.35%		

Хотя 16S РНК и так является консервативной, но в местах контактов она еще более консервативна (88.35%). Так как предполагается, что белок S7 играет ключевую роль в процессе сборки малой субчастицы рибосомы, то процесс сборки представляется идентичным или, по крайней мере, сходным у разных организмов. 
Высокая консервативность, возможно, предполагает структурное сходство, что позволяет нам применить компьютерное моделирование к изучению структуры белка EcoS7 и его комплекса с рРНК.
Моделирование структуры EcoS7.
Высокая гомология зоны контакта белка позволяет применить подход построения модели структуры S7 E.coli по известной структуре белка-гомолога TthS7 с помощью Swiss-Model [8]. В результате получили 3D структуру, не образующую найденные РНК-белковые связи. Известно, что Swiss-Model создает 3D модель, основываясь на известных структурных элементах. То есть положение С атомов модели EcoS7 совпадает с их же положением в TthS7. Что не может не привести к ошибкам при попытке моделирования белка EcoS7. Для корректного моделирования необходимо провести оптимизацию.
Смоделированный Swiss-Model белок S7 Escherichia coli (слева) и полученный методом РСА белок S7 Thermus thermophilus (справа).

Оптимизация структуры белка EcoS7 в комплексе с 16S рРНК
Полученная модель белка S7 E. сoli при замещении белка S7 Т. thermophilus в составе комплекса из 30S субчастица обладает рядом недостатков. Наблюдались сверхблизкие контакты (< 2,4 Å, вплоть до 0,2 Å). Что не позволяло привести моделирование вероятного взаимодействия белка S7 E. coli с 16S рРНК. Для решения возникшей задачи было применены протокол EM (energy minimization) и SA (simulated annealing). Результатом применения протокола EM является структура без высокоэнергетических взаимодействий между атомами, с незначительным изменением положения атомов. В случае SA протокол предпологает быстрое охлаждение (1 пикосекунда) структуры 2000 К до 0. Результатом подобной операции является структура с минимальной потенциальной энергией (в вакууме это означает наибольшее количество энергетически выгодных взаимодействий).

Средством для выполнения этих задач был выбран пакет программ Gromacs 3.1.4 [9,10]
Минимизация энергии проводилось в вакууме. Для параметризации межатомных взаимодействий было использовано силовае поле GMX входящее в состав пакета программ Gromacs 3.1.4. 
Протокол выполнения EM. 
pdb2gmx -f $MOL}.pdb -o ${MOL}.gro -p ${MOL}.top
editconf -f ${MOL}.gro -o ${MOL}.gro -d.5
grompp -n -f em -c ${MOL} -p ${MOL} -o ${MOL}_em 
mdrun -nice 4 -s ${MOL}_em -o ${MOL}_em -c ${MOL}_after_em -v >& ! try2	

Параметры EM.
Поскольку  установленные по умолчанию параметры EM не привели к нужному уровню минимизации энергии, то был проведен поиск параметра emstep и найдено оптимальное значение 0.02 (по умолчанию 0.01).
title               =  gin2
cpp                 =  /lib/cpp
define              =  -DFLEX_SPC
constraints         =  none
integrator          =  steep
dt                  =  0.002
nsteps              =  5000
nstlist             =  10
ns_type             =  grid
gen_vel             =  yes
gen_seed            =  173529
emtol               =  1000.0
emstep              =  0.02	
Что привело к изменению максимальной силы взаимодействия между атомами с.64330e+18 до 7.94900e+02 кДж/(моль*нм). Результатом данной операции является структура без высокоэнергетических взаимодействий между атомами. Однако такой подход не позволяет найти структуру белка, оптимальную для комплекса с РНК так как этот протокол не учитывает низкоэнергетических взаимодействий (водородные связи, электростатические взаимодействия и т. п.).

Для нахождения оптимальных конфигураций боковых цепей аминокислотных остатков был использован протокол SA.
Протокол выполнения SA.
grompp –f md –n –c ${MOL}_after_em  -p ${MOL} -o ${MOL}_md
mdrun -nice 4 -s ${MOL}_md -o ${MOL}_md -c ${MOL}_after_md2 -v &	
Параметры SA.
При оптимизации структуры белка EcoS7 положение всех атомов рРНК в пространстве было неизменно (координаты были заморожены). В связи с тем, что ранее в нашей лаборатории методом MD (molecular dynamics simulation) было показано, что модель белка EcoS7 в растворе , полученна с помощью сервиса Swiss-Model сохраняет все структурные элементы, что позволяет при использовании протокола SA заморозить координаты С атомов для созранения хода цепи при высокой температуре. Таким образом производилась поиск оптимальных позиций для боковых радикалов аминокислот. 
title               =  gy
cpp                 =  /lib/cpp
constraints         =  all-bonds
integrator          =  md
dt                  =  0.002    
nsteps              =  500      
nstcomm             =  1
nstxout             =  500
nstvout             =  0
nstfout             =  0
nstlist             =  10
ns_type             =  grid
;pbc                 =  no
rlist               =  1.0
rcoulomb            =  1.0
rvdw                =  1.0
freezegrps          =  RNA Backbone
freezedim           =  Y Y Y Y Y Y
energygrps          =  System
; Berendsen temperature coupling is on in two groups
Tcoupl              =  berendsen
tau_t               =  0.1      0.1        0.1
tc-grps             =  Protein  RNA        MG
ref_t               = 000    000      000
; Pressure coupling is not on
Pcoupl              =  no
tau_p               =  0.5
compressibility     =  4.5e-5
ref_p               =  1.0
; Generate velocites is on at 300 K.
gen_vel             =  yes
gen_temp            = 000.0
gen_seed            =  173529
; SIMULATED ANNEALING CONTROL = 
annealing                = yes
 Time at which temperature should be zero (ps) = 
zero-temp_time           = 1	
Таким образом, была получена модель комплекса EcoS7 с 16S рРНК Tth.

Результаты и обсуждение.
На первом этапе было определено области контакта рибосомального белка S7 c 16S рРНК в структуре Tth30S. Затем были подсчитаны консервативности контактирующих аминокислотных остатков в S7 (78.79%) и рибонуклеиновых оснований 16S рРНК (88.35%) у эубактерий. результаты которых позволили предположить, что структуры комплексов TthS7 и EcoS7 с соответствующими 16S рРНК сходны, что позволило провести моделирование EcoS7 в Swiss-Model. При моделировании самого комплекса консервативность всей 16S рРНК и в особенности областей контакта с белком S7 позволило принять 3D структуру Tth16S рРНК равной структуре Eco16S рРНК. Следующим этапом  была проведена оптимизация комплекса EcoS7 с 16S рРНК Thermus thermophilus с помощью протоколов EM (energy minimization) и SA (simulated annealing). Степень отклонения была оценена с помощью RMS: RMS = 0,28 Å EM в случае EM и RMS = 1,38 Å после EM + SA. 
 В качестве контрольной системы был выбран комплекс TthS7 с 16S РНК. Были использованы идентичные протоколы с идентичными параметрами. После EM максимальная сила взаимодействия между атомами упала с 1.06956e+05 до 1.69181e+03 кДж/(моль*нм). RMS: в случае EM RMS = 0,11 Å EM в случае EM и RMS = 1,54 Å после EM + SA. 
Белки S7	Потенциальная энергия (кДж/моль)	
	До оптимизации	После EM	После SA	
Thermus thermophilus	4.43851e+15	-3.96462e+04	-4.41872e+04	
Escherichia coli	2.20259e+04	-4.06116e+04	-4.90928e+04	

Это позволяет утверждать, что проведенная  оптимизации существенна и предложенная модель позволяет проводить дальнейший анализ зоны РНК-белковых контактов EcoS7 с 16S РНК.

Список контактов оптимизированных белков S7 Т. thermophilus и E.coli c 16S рРНК Т.thermophilus и консервативность контактирующих мономеров (максимальное расстояние 3,30 Å)  
EcoS7	TthS7	Tth16S рРНК	Взаимодействующие атомы	Расстояние	Консервативность Tth16S рРНК	Консервативность S7	
Pro2	Ala2	U1380	N, 04	3,30/2,78	99,07%	3,90%(A) 44,16% (P)	
	Ala2	U1380	N2, O6	3,04	99,07%	3,90%	
Arg3		G932	NE, O2P	2,98	96.26%	96,10%	
	Arg3	G932	NH1, O2P	2,94	96.26%	96,10%	
Arg3	Arg3	U1380	N,  O4	2,84/2,94	99,07%	96.10%	
Arg3		U1380	NH1, O2P	2,75	99,07%	96.10%	
Arg4	Arg4	C931	NH2, O2*	2,96/3,22	98,13%	50,65% (+45,45% K)	
Arg4	Arg4	C932	NE, 05*	2,80/3,18	96,26%	50,65% (+45,45% K)	
Arg4		C932	NE, 01P	3,23	96,26%	50,65% (+45,45% K)	
	Arg6	C1378	NH2, 01P	2,99	97.20%	15.58% (+9,09% K)	
Gln9		A1377	NE, O2P	2,81	99.07%	12,99%	
	Arg10	U1376	NE, O4	3,15	98,13%	87,01% (+5,20% K)	
Lys25		U1376	NZ,O2P	2,97	98,13%	49,35% (+24,68% R)	
Asn28	Asn28	A1374	O, O2*	2,98/2,86	100.00%	90.91%	
Asn28	Asn28	A1375	ND2, O1P	3,03/2,69	99.07%	90.91%	
Asn28	Asn28	A1374	ND2, O3*	2,77/2,86	100.00%	90.91%	
	Lys29	A1375	NZ, O2*	2,57	99.07%	28.57%(+12,99% R)	
	Lys29	C940	NZ, O1P	2,74	92.52%	28.57%(+12,99% R)	
Leu30		U1240	O, N3	3,01	100.00%	22,08%(+31,17% I +33,77% V)	
	Arg32	A1350	NH1, O2*	3,12	99.07%	6.49% (+10,39% K)	
	Arg32	G941	NH1, O3*	3,24	92.52%	6.49% (+10,39% K)	
Asp33	Asp33	A1350	O, N3	2,90	99.07%	59.74%	
Gly34	Gly34	U1372	O, O2*	3,20/3,02	99.07%	96,10%	
Lys35	Lys35	G1241	NZ, O1P	3,21/3,20	100%	97,40%	
Lys36		G1373	NZ, O1P	3,01	98,13%	83,12% (+12,99% R)	
	Lys36	G1373	NZ,O3*	3,30	98,13%	83,12% (+12,99% R)	
	Lys36	A1374	NZ, O1P	2,22	100.00%	83,12% (+12,99% R)	
	Arg41	G1291	NH2, O1P	2,49	29.91%	31.17% (+24,57% K)	
	Arg41	G1291	NE, O1P	2,72	29.91%	31.17% (+24,57% K)	
	Arg41	G1291	NH2, O5*	3,01	29.91%	31.17% (+24,57% K)	
	Arg41	U1292	NH2, O2P	2,84	14.95%	31.17% (+24,57% K)	
Arg79		C1382	NH1, O2*	3,16	99.07%	88,31% (+1,30% K)	
Arg92		A1377	NH2, O5*	3,08	99.07%	68,83% (+6,49% K)	
Arg92		A1377	NH2, O1P	2,40	99.07%	68,83% (+6,49% K)	
	Arg94	U1376	NH2, O2P	3,26	98,13%	9.09% (+2,60% K)	
	Arg94	U1376	NH2, O5*	3,30	98,13%	9.09% (+2,60% K)	
	Arg94	A1377	NH2, O2P	2,77	99.07%	9.09% (+2,60% K)	
	Arg94	A1377	NE, O2P	2,77	99.07%	9.09% (+2,60% K)	
Arg95	Arg95	A938	NH1, O3*	2,99/2,94	100.00%	96.10%	
	Arg95	A938	NH1,  O2*	3,12	100.00%	96.10%	
	Arg95	A938	NH2, O3*	2,87	100.00%	96.10%	
	Arg95	G939	NH2, O1P	3,23	100.00%	96.10%	
Arg102		A1375	NH2, O2*	3,01	99.07%	87,01 (+5,19 K)	
Arg102		G939	NE, O3*	3,10	100,00%	87,01 (+5,19 K)	
Arg102		C940	NE, O1P	2,77	92.52%	87,01 (+5,19 K)	
	Arg102	G939	NH1, O1P	2,82	100,00%	87,01 (+5,19 K)	
	Arg102	C940	NH2, O2P	3,06	92.52%	87,01 (+5,19 K)	
	Arg109	U1240	ND2, O4	2,93	100,00%	3.90%	
Lys114	Arg114	A1239	O, O2*	3,05/2,82	100.00%	70.13% (R.K)	
Lys114	Arg114	U1240	O, O1P	3,19/3.03	100.00%	70.13% (R.K)	
	Arg114	C1297	NH2, O2*	2,75	57.01%	(R.K) 70.13%	
	Arg114	C1298	NH2, O2P	2,91	98.13%	70.13% (R.K)	
Met116	Ala116	U1240	N, O2P	2,63/2,64	100.00%	88,31%/5,19%	
Arg 119		U1240	NH2, O1P	3,27	100.00%	50.65% (+40,26% K)	

В ходе анализа контактов было установлено, что TthS7 образует около 40 контактов из них большинство (30) способно образовывать водородные связи. В то время как EcoS7, образует 28 контактов и 21 из них способны образовывать водородные связи. Белок TthS7 в составе малой субчастицы не образует контактов -листом с рРНК [1], в то время как существуют биохимические данные о том, что Lys75, ,  способен сшиваться с рРНК [11]. Необходимо напомнить, что основная масса известных на сегодня данных относятся к E.coli. В полученной нами модели Arg79, который тоже принадлежит -листу, находится в плотном контакте с C1382. Наблюдаемое различие между моделью комплекса EcoS7 и рРНК и данными по сшиванию можно объяснить тем, что для сшивания использовался специальный реагент, увеличивающий длину сшивки до 10А[11]. С другой стороны делеционный анализ EcoS7 показал, что для связывания с рРНК необходим -лист [12], это позволяет полагать, что предложенная нами  модель, содержащая контакты  -листа белка  EcoS7 функциональна.

Выводы.
1.	Методами компьютерного анализа и моделирования in silico показано, что два белка-аналога EcoS7 и TthS7 по первичной структуре идентичны на 52%, а в зоне РНК-белковых контактов в 30S субчастице – на 88.35%.
2.	Предложена модель структуры белка EcoS7.
3.	Предложены оптимизированные модели структуры белков EcoS7 и TthS7 в комплексе с рРНК.
4.	Контакты оптимизированной модели белка EcoS7 хорошо соотносятся с биохимическими данными.

Список литературы.

[1]	Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T. and Ramakrishnan, V. (2000) Nature 407, 327-39.
[2]	Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H. and Noller, H.F. (2001) Science 292, 883-96.
[3]	Dragon, F. and Brakier-Gingras, L. (1993) Nucleic Acids Res 21, 1199-203.
[4]	Wimberly, B.T., White, S.W. and Ramakrishnan, V. (1997) Structure 5, 1187-98.
[5]	Hosaka, H., Nakagawa, A., Tanaka, I., Harada, N., Sano, K., Kimura, M., Yao, M. and Wakatsuki, S. (1997) Structure 5, 1199-208.
[6]	Brewer, L.A. and Noller, H.F. (1983) Biochemistry 22, 4310-5.
[7]	Guex, N. and Peitsch, M.C. (1997) Electrophoresis 18, 2714-23.
[8]	Schwede, T., Kopp, J., Guex, N. and Peitsch, M.C. (2003) Nucleic Acids Res 31, 3381-5.
[9]	Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D., van Drunen, R. (1995) Comp. Phys. Comm. 91, 43–56.
[10]	Lindahl, E., Hess, B., van der Spoel, D. (2001) J. Mol. Mod 7, 306–317.
[11]	Urlaub, H., Thiede, B., Muller, E.C., Brimacombe, R. and Wittmann-Liebold, B. (1997) J Biol Chem 272, 14547-55.
[12]	Dragon, F., Payant, C. and Brakier-Gingras, L. (1994) J Mol Biol 244, 74-85.