Материалы к заданию 11

Как найти мотивы Prosite, представленные в данной последовательности?

Зайдите на страницу Prosite.

Сайт Expasy, составной частью которого является Prosite, имеет несколько зеркал: корейское (http://kr.expasy.org), китайское (http://cn.expasy.org), бразильское (http://br.expasy.org), канадское (http://ca.expasy.org) и австралийское http://au.expasy.org). На данный момент (24 апреля 2008 г.) сервис Prosite работает на всех зеркалах (см. ответ, пришедший на моё письмо в Prosite), но всякое может быть...

В окошко "Scan a sequence against PROSITE patterns and profiles" внесите либо последовательность, либо её AC или ID в UniProt и нажмите "Scan". Дождитесь результата. На странице с результатами подробная информация о найденных паттернах и профилях доступна по гиперссылкам, привязанным к номерам доступа записей Prosite (начинаются с "PS", например PS00033).

На страничке с документацией паттерна вам нужны разделы Description (кратко переводите или пересказываете своими словами описание и вставляете в протокол) и Technical section. В последнем можно найти как сам паттерн, так и его характеристики (сколько последовательностей семейства им не находятся и сколько лишних находятся).

Как найти последовательности белков из организмов данного таксона, соответствующих данному паттерну?

Первый способ. Со страницы Prosite пойдите по гиперссылке "ScanProsite". В правой колонке (Motif(s) to scan for) в окошко внесите либо сам паттерн, либо его идентификатор в Prosite. Ниже в подразделе Filter(s): внесите в окошко "On taxonomy" название таксона (без опечаток! Правильно ли вы пишете название таксона, можно проверить, например, в таксономической базе EBI) и нажмите "START THE SCAN" (в левом нижнем углу страницы).

Второй способ. Воспользуйтесь командой fuzzpro пакета EMBOSS. Чтобы ограничить поиск, скажем протеобактериями, можно указать в качестве последовательностей для поиска "sw-org:proteobacteria". Чтобы каждый раз не выписывать длинный паттерн в ответ на вопрос или в командной строке, можно поместить его в файл (без переносов строки!) и вызывать в командную строку следующим образом:

  fuzzpro -pattern "`cat mypattern.txt`"

(здесь "mypattern.txt" — имя файла, двойные кавычки защищают возможные в паттерне пробелы и скобки, а обратные кавычки означают, что в это место должен быть вставлен результат выполнения команды; в данном случае это команда cat, выводящая на stdout содержимое файла). Список находок в простой форме можно получить из выходного файла командой grep.

Как построить выравнивание?

На kodomo-count установлены три программы выравнивания: emma, muscle и mafft. Для выравнивания небольшого числа последовательностей рекомендуется вариант mafft, вызываемый командой einsi:

  einsi sequences.fasta > alignment.fasta

для быстрого выравнивания большого количества последовательностей — muscle. Предварительно, разумеется, надо создать файл с последовательностями в fasta-формате.

Как работать с GeneDoc, см. здесь (обратите внимание на п.11 — в нашем случае тоже надо создать группу, но включить в неё последовательности из подсемейства). Рекомендуется покрасить исходный паттерн во всех последовательностях (см. пункт 4); если вдруг паттерн не выровнялся, то поправьте выравнивание вручную.

Чтобы подровнять к готовому выравниванию ещё одну последовательность, можно использовать программу mafft-profile:

  mafft-profile alignment.fasta sequence_add.fasta > alignment2.fasta

Впрочем, можно и руками в GeneDoc.

Как сравнивать списки находок?

Один вариант — делать это средствами MS-Excel. В частности, может помочь функция "ВПР" ("VLOOKUP"), которая позволяет проверить присутствие данного значения в данном массиве.

Другой (и предпочтительный) вариант — писать Perl-скрипты.

Как строить профиль и искать в банке последовательности, соответсвующие профилю?

Воспользуйтесь пакетом PFTOOLS, установленном на kodomo-count (программы pfw, pfmake, autoscale и pfsearch). Имеет смысл почитать manuals:

  man pfw
  man pfmake
  man pfsearch

Вот краткая инструкция:
• Приготовьте входной файл в формате MSF (именно в этом формате сохраняет GeneDoc); пусть (например) файл называется xxxxxxx.msf. Последующие действия выполняются на kodomo-count.
• Замените символы конца строки файла, созданного в Windows, на принятые в UNIX:

  noreturn xxxxxxx.msf xxxxxxx.noreturn.msf

• Рассчитайте веса последовательностей выборки:

  pfw xxxxxxx.noreturn.msf  > xxxxxxx.weighted.msf

• Создайте профиль:

  pfmake xxxxxxx.weighted.msf /usr/share/pftools23/blosum45.cmp > xxxxxxx.prf

• Проверьте профиль. Для этого откройте его редактором Far. На этом этапе возможна его ручная корректировка в известных вам функционально значимых позициях.
• Нормируйте профиль. Полная процедура требует значительных затрат компьютерного времени. Поэтому можно ограничиться "лёгкой" нормировкой (относительно маленькой базы 'случайных' последовательностей), она занимает минуты:

  autoscale -m xxxxxxx.prf  >  xxxxxxx.scaled.prf

  Найдите, что изменилось в профиле! Редактировать вручную нормированный профиль уже нельзя — нормировка "собьётся".

  Если есть желание, выполните нормировку относительно большой базы 'случайных' последовательностей (SwissProt, в котором перемешаны буквы во всех последовательностях) — так же, но опустив параметр -m. Нормировка по большой базе занимает несколько десятков минут.

• Подготовьте файл с последовательностями для поиска:

  seqret sw-org:bacteria bacteria.fasta

  (все последовательности из бактерий). Следите за квотой — результирующий файл "весит" почти 80M! После окончания работы будет необходимо его удалить.
• Поиск по профилю:

  pfsearch -f xxxxxxx.scaled.prf bacteria.fasta  > xxxxxxx.pfsearch 

  (параметр '-f' говорит, что файл с последовательностями имеет формат fasta). Поиск займёт около 10 минут.
• Изучите результат. Находки в результирующем файле упорядочены по алфавиту названий белков; показатель качества (нормализованный вес выравнивания профиля с последовательностью) стоит в первой колонке. Дополнительные параметры программы pfsearch можно узнать так:

  pfsearch -h

  Важный параметр такой: "-C<число>" (например -С6.2). Это порог нормализованного веса, отделяющий находки. По умолчанию равен 8.5. Чтобы убедиться, насколько хорошо отделяет профиль правильные находки от неправильных, иногда интересно снизить этот порог, чтобы получить в выдаче и заведомо неправильные находки; обычно у неправильных находок нормализованный вес < 6.5
• Выберите порог нормализованного веса, проанализировав результат поиска. Вам нужно понять, какие значения нормализованного веса дают белки подсемейства и какие — прочие белки (это можно делать средствами Excel и/или Perl). Полезно построить гистограмму значений нормализованного веса находок. Если профиль хороший, у такой гистограммы обычно наблюдается локальный минимум в районе правильного порога.
• Сформулируйте результат, полученный с помощью профиля: "при таком-то пороге находятся столько-то последовательностей, принадлежащих подсемейству, столько-то не принадлежащих подсемейству и столько-то последовательностей подсемейства не находятся".