- Сбор информации о своем белке:
- Определите EC-код своего белка (можете воспользоваться IUBMB или BRENDA). Если ваш белок не фермент, возьмите белок соседа снизу по списку.
- Расшифруйте код своего белка и переведите на русский активность, соответствующую каждому из четырех чисел кода.
Можно воспользоваьтся опцией EC explorer BRENDA или пройти по сслыкам с главной страницы IUBMB.
- Приведите картинку с реакцией, катализируемой вашим ферментом. Добыть ее можно из BRENDA или KEGG. Если картинок не приводят, опишите реакцию словами.
В BRENDA пользуйтесь кнопочкой с пробиркой, в KEGG найдите свой белок на главной странице, затем перейдите по ссылке KEGG Reaction
- Вы сдаете микробиологию и вам нужно быстро найти, есть ли цикл Кребса у клостридий.
Воспользуйтесь KEGG, найдите правильный ответ и приведите в отчете картинку из KEGG в подтверждение.
На главной странице KEGG в поле поиска введите цикл Кребса (для этого придется найти, как его называют буржуи). На странице результатов поиска могут вылезти результаты для всех 16 баз KEGG - вам нужна ссылка на pathway, вроде map00020 (кстати, можно было с самого начала сузить поиск до базы данных KEGG pathway, выбрав ее на главной странице). Попадете на страницу с большой таблицей. Перейдите по ссылке на карту пути - поле Pathway map таблицы. Увидите картинку с картой пути. Сверху там есть выпадающий список - выберите, к примеру, Clostridium Acetobutilicum, и нажмите "Go". Зеленым на карте будут подсвечены те ферменты, которые есть у данного организма.
- Вы хотите узнать, зачем нужна карбангидраза, если угольная кислота и так превращается в углекислый газ за секунду. Найдите в BRENDA число оборотов фермента при нормальном pH (для нормального человеческого белка и без добавления специальных буферов к раствору), а так же, как оно изменяется при закислении среды, например, при физической работе или похмелье. Также определите, с какими болезнями связан фермент, мишенью каких лекарств он является. Перечислять не обязательно; предположите, почему для такого безобидного фермента их столько.
Поищите быстрым поиском на главной странице BRENDA. В navigtaion frame слева найдите turnover number и disease, кстати, можно посмотреть еще inhibitors (ингибиторы карбангидразы - лекарство от глаукомы). Таблетки можно посмотреть также в KEGG. Если найти фермент, то у него будет ссылка на KEGG drug и KEGG disease, а на метаболическом пути (почему-то метаболизма азота) синим будут помечены белки, связанные с болезнями, а красным - мишени лекарств.
- Ваши однокурсники играли на зачете в забавную игру: дойти по ссылкам за наименьшее количество ходов с одной страницы википедии до другой. Там эта задача чаще всего решается через английскую королеву (см. Erdos numbers). Сделайте то же самое в KEGG - дойдите от глюкозы до глютамата за наименьшее число ходов (организм выбирать не надо, ходите просто по reference pathway). Приведите в отчете картинку с картами путей KEGG, на которой обведен ваш кратчайший путь.
- Вы по ошибке оставили пробирку с Taq-полимеразой (той, которую используют в полимеразной цепной реакции) в термостате при температуре 90 градусов на десять минут, и теперь не уверены, пережил ли такое обращение ваш фермент, и какое его количество распалось. Найдите в BRENDA, насколько он устойчив при данной или сопоставимой температуре.
- Нарисуйте в BRENDA какой-нибудь дихлофос или что вам больше нравится и найдите самые похожие на него реагенты, которые участвуют в ферментативных реакциях (я вот нашел в человеке фермент, окисляющий ракетное топливо - диметилгидразин). Опишите функцию фермента, взаимодействующего с вашим химикатом.
Воспользуйтесь кнопкой substructure search на главной странице KEGG - у вас запустится Java-апплет для рисования соединений; если не запустился - включите или установите Java-машину - Java Runtime Environment.
- Поищите гомологов теломеразы у прокариот в KEGG. Если сочтете, что степень родства достаточная, приведите их в отчете.
Для этого найдите в KEGG сам фермент, перейдите по ссылке на его ген, на странице гена щелкните по кнопке "гомологи", и перед вами окажется интерфейс наподобие BLAST. Установите область поиска - прокариот (после того как выбрали их из списка не забудьте щелкнуть кнопку-подтверждение). Поищите лучшего bidirectional best hit - выберите опцию best-best. На результаты смотрите так: bit-score связан с e-value как e-value = bank_size * query_length / 2^bit_score. Соответственно, бит-скор на уровне 30 - это e-value на уровне единицы, а то и больше.
- Допустим, ваши коллеги из мокрой лаборатории собираются исследовать некий потенциально токсичный экскретируемый белок из Bacillus Subtilis, к примеру, субтилизин SUBT_BACSU (субтилизин, правда, хорошо изучен; в качестве более реального примера можете взять предполагаемый белок экскретируемой эндонуклеазы из Bacillus Thuringiensis с кодом ZP_04127279.1 с NCBI protein - если просто вбить этот идентификатор на ncbi.nlm.nih.gov в поле поиска, найдется запись данного белка). Для этого им нужен препарат белка, очищенный и концентрированный. Для получения такого препарата ген этого белка часто искусственно переносят в организм-продуцент (обычно - E.Coli, потому что она быстро растет и методы работы с ней хорошо обкатаны; кроме того, исходная бактерия могла быть некультивируемой или плохо культивируемой, так что иначе никак). После этого E.Coli заставляют наработать большое количество исследуемого белка и получают его препарат.
Однако, если всю кодирующую последовательность вашего белка из Bacillus subtilis (грамположительной бактерии, то есть за мембраной и клеточной стенкой у нее сразу внешний мир) перенесли в E.Coli (грамотрицательную бактерию, то есть у нее мембран две, а между ними - периплазма), и начали нарабатывать белок, то большой вопрос, куда он пошел. И если никуда не пошел, а остался в цитоплазме, то у E.Coli есть все шансы сдохнуть сразу (впрочем, с субтилизином ей как раз повезло, он сначала синтезируется в виде просубтилизина и требует активации, чтобы начать работать, следовательно, вредить). Предложите, что нужно изменить в последовательности белка, чтобы поменять локализацию, например, чтобы E.Coli экскретировала его наружу.
Предлагаю следующие шаги:
- Посмотрите в KEGG карту путей секреции у бактерий. На страничке описания метаболического пути есть литературные ссылки, которые помогут разобраться получше, что определяет, как будет локализован тот или иной белок в бактерии. Если по этим ссылкам вам не удается сразу найти нужную информацию, попоробуйте пункты 2 и 3 как альтернативу.
- Другой хороший способ: с помощью формы advanced search в BRENDA можно наловить внеклеточных белков из Bacillus subtilis, задав в поле "localization" "extracellular", посмотреть литературные ссылки, касающиеся их локализации и механизмов транспорта, а также данные, касающиеся клонирования и их экспресии в других бактериях (многие из них уже клонировали в E.Coli, и как-то добивались их правильной локализации).
- Наконец, можете просто поковыряться в Интернете c Google, Wikipedia, Google Books, Google Scholar, Pubmed или воспользоваться сарафанным радио, чтобы разузнать, что людям известно об этих системах и признаках того, что тот или иной белок использует какую-либо систему.
- Сделайте предположение, как данный белок секретируется Bacillus Subtilis. В выдвижении гипотезы и ее проверке вам могут также помочь программы отсюда: http://www.cbs.dtu.dk/services/
- Посмотрите в KEGG, есть ли у E.Coli система секреции, гомологичная той, которую использует исследуемый белок. Туда ли она ведет?
- Даже если гомологичная система имеется, не факт, что специфичность узнавания сигнала одинакова у разных бактерий. С помощью того же датского сервиса можно посмотреть предсказания для узнавания того же мотива грамотрицательными бактериями.
- На основании собранных данных предположите, как бы можно было изменить последовательность данного вам белка так, чтобы E.Coli его секретировала.
Задание полуреальное, взято из практики, и оценивается неформально, то есть все средства хороши, любая ваша самостоятельная активность приветствуется. Это пример того, как можно быстро "въехать" в прикладные аспекты незнакомой области молекулярной биологии.