Занятие 4.

Деревья в обоих заданиях следует строить программой MEGA, любым из методов Neighbor-Joining, Minimum evolution, Maximum likelihood. Указывайте в отчётах, какой метод был использован.

Построение дерева по нуклеотидным последовательностям

Постройте филогенетическое дерево тех же бактерий, что в предыдущих заданиях, используя последовательности РНК малой субъединицы рибосомы (16S rRNA).

В отчёте приведите:

• таблицу, в которой для каждой из бактерий указаны: AC записи EMBL, в которой нашлась последовательность 16S rRNA, координаты этой РНК в этой записи, на прямой или комплементарной последовательности оказалась последовательность этой рРНК;
• какой программой были выровнены последовательности;
• каким методом реконcтруировалось дерево;
• изображение дерева (листья должны быть помечены мнемониками видов);
• анализ дерева: совпадает ли с правильным? Если нет, сколько ветвей реконструированы неверно? Что можно сказать о качестве реконструкции по сравнению с деревьями, построенными по белкам?

Этапы работы

1. Добудьте последовательности 16S рибосомальной РНК каждой из бактерий. Это можно сделать несколькими способами. Самый, по-видимому, простой способ: найти запись EMBL, описывающую полный геном бактерии, а в ней — соответствующую "особенность" (FT), она имеет ключ (FTkey) "rRNA" и в описании, как правило: /note="16S rRNA" (иногда может быть упоминание 16S или малой рибосомной субъединицы в другой форме). Ссылку на запись EMBL, описывающую полный геном, проще всего найти в записи Swiss-Prot, описывающей какой-нибудь белок той же бактерии. Часто в геноме имеется несколько копий рРНК, надо взять любую одну. Скачать на свой компьютер полную запись EMBL можно программой entret. Дальше ищите в поле FT координаты (и направление!) рРНК.

   Вырезать нужный участок из записи EMBL с AC (к примеру) X00000 можно командой
   seqret embl:x00000 -sask
   Обращайте внимание на то, чтобы правильно ответить на все вопросы программы seqret!

2. Положите все последовательности в единый файл в fasta-формате, отредактируйте их названия, чтобы они отвечали организмам, и выровняйте.
    
3. Файл с выравниванием импортируйте в программу MEGA (указав Analyze при импорте) и выберите один из методов "верхней тройки" в меню "Phylogeny".
    
Замечание. В записи EMBL, описывающей полный геном одной из бактерий, рРНК не аннотированы. Если эта бактерия оказалась в вашем списке, можно поступить двумя способами:
Первый вариант: исключить эту бактерию из списка; в этом случае необходимо привести "правильное" (полученное из образца) дерево для нового сокращённого списка, и такие же ограничения полученных ранее белковых деревьев.
Второй вариант (предпочтительный): всё же найти 16S РНК в геноме этой бактерии. Для этой цели хорошо подходит программа blastn, которая, в частности, умеет быстро выравнивать две последовательности (в данном случае полный геном данной бактерии и 16S РНК какой-либо близкородственной бактерии). Запустите blastn -help, чтобы получить подсказку, и обратите внимание на параметры -query и -subject; правильно будет также указать -task blastn. Из выдачи blastn необходимо получить как координаты, так и направление рРНК в геноме.
 

Построение и анализ дерева, содержащего паралоги

Найдите в своих бактериях достоверные гомологи белка CLPX_BACSU. Постройте дерево этих гомологов. Считая дерево реконструированным верно, укажите несколько пар ортологов и несколько пар паралогов. Приведите примеры отражённых на дереве эволюционных событий двух типов: 1) дупликация гена; 2) разделение путей эволюции белков в результате видообразования.

Указание. Два гомологичных белка будем называть ортологами, если они а) из разных организмов; б) разделение их общего предка на линии, ведущие к ним, произошло в результате видообразования. Два гомологичных белка из одного организма будем называть паралогами.

Чтобы найти гомологов в заданных организмах, воспользуйтесь файлом proteo.fasta на диске P, там лежат записи банка UNIPROT, относящиеся к бактериям, перечисленным в таблице к заданию 1. Необходимо провести поиск программой blastp гомологов (с разумным порогом на E-value, скажем, 0,001) и отобрать по мнемонике видов только те находки, которые относятся к отобранным вами бактериям. Другой способ — несколько раз воспользоваться BLAST'ом на сайте NCBI, устанавливая фильтр по организму, а в качестве банка — "nr" (поскольку Swiss-Prot может содержать не все гомологи). Если пользоваться этим способом, то придётся, чтобы не запутаться в том, какие белки из какого организма, придумать систему названий белков и переименовывать их сразу после скачивания.