Учебный сайт Макаровой Надежды

Третий семестр

Мембранные белки

Анализ множественного выравнивания трансмембранных белков

Цель задания: (1) проверить корректность предсказания сервиса TMHMM и (2) проверить консервативность различных частей трансмембранных белков.

Дан белок антипортер аргинина и агмантина AdiC с PDB: 3l1l_A

Для составления репрезентативной выборки гомологов данного белка был произведен поиск по базе UniRef50 с помощью Blast EBI. Я взяла 250 находок, e-value лучшей - 0.0, худшей - 1.8E-29. Результаты поиска можно посмотреть в виде картинки по ссылке . Затем было построено множественное выравнивание найденных белков и исходного белка. Для построения использовалась программа Muscle. Полученное выравнивание гомологов в формате fasta: aln.fasta. Из данного файла с выравниванием удалены последовательности, слишком короткие по сравнению с остальными. Эти белки имели идентификаторы: 

W1YJ57
D8AFF8
UPI0007517375
UPI0001A54559
4MVC1
UPI00070D7359
UPI0006ACFFA2
UPI0006ACEBC7
A0A0H6SGA5
G5LSA3
A4MVC0
K1ZM22
W1W673
A0A0W0QD49
A0A136Q9E1
S6F269
A0A0H6MPQ2
A0A0H5VZG2
D2YQY4
A0A0T9WRZ4
A0A0D8L236
N2Q7E0
A0A0E3JQB6
K8BF65
W9EBQ3
W1Y304
W1XEZ3
Q846V3
A0A063BIY5
I6EQZ7
UPI0005643493
D7YJ03
A0A0F9NIW9
T0D5V7
A0A0F4IPY0
Q0SXE7
A0A0H6S9C4
A8UJ68
UPI000682919B
R8QXL0
UPI0007A630DA
K6Z5Y3
A0A136A5L0

Файл с итоговым выравниванием(гомологи + наш белок): fasta.

Затем был создан проект JalView. На основании известной структуры была добавлена строка аннотации "TM_REAL" с указанием трансмембранных участков (помечены буквами M и U).

Далее с использованием сервиса TMHMM были предсказаны трансмембранные участки для одного из гомологов - U7UH96. Результат представлен на Рис. 1. Описание предсказанных трансмембранных участков представлено в строке аннотации "TM_PREDICTED" в том же JalView-проекте. Для сравнения есть еще строка аннотации "TM_REAL_U7UH96", чтобы посмотреть, насколько выбранный гомолог отличается от исходного белка по структуре.

Рисунок 1. Результат предсказания трансмембранных участков для белка U7UH96 с помощью сервиса TMHMM.

Оценка предсказаний

Рисунок 2. Структура белока AdiC c сайта PDB

У моего белка 12 трансмембранных спирали (Рис. 2). Программа нашла все 12. Однако границы каждой спирали не совпадали. Отличались в пределах от 1 до 12 (считая только с одний стороны). Интересно, что у самого белка U7UH96 нет первой спирали, но TMHMM ее определил. Но возникла ситуация, когда есть спираль, но это не трансмембранный участок, а участок обращенный к цитоплазме (Рис.3). Даже в PDB изображении видно, что это спираль.Однако по топологии UniProt участок числится как 'Topological domain Cytoplasmic' длиной в 39 а/к (обозначен в проекте JalView 'c'). Здесь программа наиболее ошибочно определила границы трансмембранный участок относительно известных для нашего белка, но относительно U7UH96 верно. В целом предсказания довольно точны.

Рисунок 3. Область выравнивания с участком спирали, которая является не трансмембранной, а цитоплазматической у нашего белка AdiC, но я вляется трансмембранной у выбранного для построения трансмембранных участков гомолога U7UH96. Первая аннотация - известная структура U7UH96. Вторая - предсказания TMHMM. Третья - известная структура для нашего белка.

Чтобы посмотреть, где распологаются наиболее консервативные участки и каков у них характер (гидрофобный/гидрофильный), прикрепленная к последовательности нашего белка PDB структура была окрашена с использованием цветовой схемы Hydrophobicity с порогом идентичности 15% (Рис. 4)

Рисунок 4. Белок AdiC с окраской по гидрофобности JalView Hydrophobicity (гидрофобные а.о. - красные, гидрофильные незаряженные - фиолетовые, гидрофильные заряженные - синие) и порогом идентичности 15%. Часть белка, обращенная к p-стороне мембраны, находится снизу.

  • Внутри трансмембранных спиралей есть консервативные участки, содержащие гидрофобные аминокислотные остатки (I, L, M, W, V, F, P, а также глицин.)
  • Внутри трансмембранных спиралей попадаются гидрофильные остатки (S, E), но значительно реже. Относительно много полярного и консервативного тирозина. Эти остатки могут координировать (+)заряженный аргинин и его производные в других транспортерах.
  • В межспиральных участках встречаются очень консервативные позиции P, G, Y, F, K. Относительно консервативен цитоплазматический участок, обсуждаемый ранее (Рис.3)

Рисунок 5. Положение белка AdiC в мембране. Положительно заряженная часть мембраны показана КРАСНЫМИ шариками
  • Толщина гидрофобной части мембраны: 28.8 ± 1.4 Å
  • Среднее количество остатков в трансмембранной части белка: 231а/к
  • Белок находится во внутренней мембране грам-отрицательной бактерии Escherichia coli
Белок, в трансмембранной части которого не α-спирали, а β-листы - Outer membrane porin F (PDB - 4rlc)

Рисунок 6. Положение белка porin F в мембране. Положительно заряженная часть мембраны показана КРАСНЫМИ шариками
  • Толщина гидрофобной части мембраны: 24.2 ± 1.3 Å
  • Среднее количество остатков в трансмембранной части белка: 74а/к
  • Белок находится в науружной мембране грам-отрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa

В БД TCBD из двух белков с идентификаторами 3l1l и 4rlc. Нашелся только последний с трансмембранными β-листами. TC1.B.6.1.2

  • 1. - Channels/Pores
  • 1.B. - β-Barrel Porins
  • 1.B.6. - The OmpA-OmpF Porin (OOP) Family
  • 1.B.6.1.2 - OmpF (OprF) porin.
  • Функция: образует поровый канал у бактерий. Также играет роль в определении формы клеток и способности расти в условиях низкой осмолярности. Порины увеличивают вирулентность бактерий посредством подавления фагоцитоза. Мутации в генах поринов могут приводить к появлению устойчивости бактерий к антибиотикам.

***