Целью этого практикума является определить экзон-интронную структуру гена и описать его альтернативный сплайсинг, используя программы GENSCAN и UCSC Genome Browser. Для анализа мне дан фрагмент ДНК из генома человека.
GENSCAN - программа предназначенная для предсказания интрон-экзонной структуры генов в геномах различных организмов. Подав на вход программе нашу последовательность из генома человека, мы получили вероятную интрон-экзонную структуру генов, входивших в этот участок. Результат GENSCAN представлен в Таблице 1.
Таблица 1. Экзонно-интронная структура гена в данном фрагменте ДНК человека, найденная при помощи GENSCAN
Предскажем структуру гена другим способом, а именно используя геномный браузер (Genome Browser). Геномный браузер выравнивает исходный ген со всевозможными мРНК и EST последовательностями.
Программа BLAT позволяет искать последовательности в геноме с учетом его фрагментации. Я ввела свой фрагмент в текстовое поле формы, выбрала поиск в геноме человека, а так же сборку hg38 (Dec. 2013). Среди находок выбрала находку с наибольшим весом и идентичностью 99,9%.
Перейдя к просмотру данного фрагмента, я спрятала все опции за исключением некоторых. В итоге я получила выравнивания моего гена со сплайсированными EST и мРНК человека.
Проанализируем для мРНК последовательностей (Рис.1).
Начало
Конец
Цепь
Тип
636
648
+
начальный
4515
4551
+
внутренний
4679
4730
+
внутренний
6040
6163
+
внутренний
10329
10515
+
внутренний
14689
14856
+
внутренний
19222
19433
+
внутренний
20905
21054
+
внутренний
24436
24468
+
внутренний
24787
24905
+
внутренний
28539
28778
+
внутренний
31033
31195
+
внутренний
31534
31631
+
внутренний
31899
32096
+
конечный
Рис.1. Выравнивания данного гена и мРНК человека. Красная рамка - пример кассетного экзона, зеленая - альтернативного донорного сайта.
Самая распространенная форма альтернативного сплайсинга у млекопитающих это кассетный экзон. На Рис.1 я выделила красной рамки как раз такие участки. Транскрипт AL833489 включает экзон, а все остальные находящиеся в рамке нет. Так же экзон встречается в мРНК AK056309, в то время как ни в одной другой найденной не стречается. С некоторой натяжкой последовательности в зеленой рамке иллюстрируют альтернативный донорный сайт.
Рассмотрим EST последовательности.
Рис.2. Выравнивания данного гена и сплайсированных EST. Красная рамка - пример кассетного экзона.
Анализируя EST последовательности приходится смотреть лишь на внутренние экзоны, так как внешние обрываются в произвольно обрываются. В общем, мы видим довольно схожую картину для всех последовательностей, лишь в некоторых местх я обнаружила кассетный экзон (например транскрипт имеющий экзон BG389344).
Мне дан фрагмент ДНК из генома киви Actinidia chinensis.
Проаннотируем этот фрагмент, определим интрон-экзонную структуру генов и их функцию. При запуске blastx я исключила поиск по моделям и пробам среды (Models (XM/XP) и Uncultured/environmental sample sequences). Искала тоьлко в базе данных Swiss-Prot, чтобы использовать только экспериментально наблюдавшиеся белки. Ограничила поиск только белками растений (Viridiplantae) и исключить из поиска геном винограда Vitis vinifera.
В результате было найдено 7 генов. Подробная информация о них приведена в Таблице 2,3,4,5,6,7.
Таблица 2. Экзонно-интронная структура гена, кодирующего ингебитор диссоциации ГДФ, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
Очень не типично существование генов у эукариот, не содержащие никакие интроны, а лишь один экзон. В данном случае такие гены нашлись (Таблица 3,5,6).
Таблица 3. Экзонно-интронная структура гена, кодирующего белок Ycf2, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
Таблица 4. Экзонно-интронная структура гена, кодирующего фактор элонгации Tu, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
Таблица 5. Экзонно-интронная структура гена, кодирующего фактор транскрипции MYB1R1, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
Таблица 6. Экзонно-интронная структура гена,кодирующего фактор транскрипции DIVARICATA, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
Таблица 7. Экзонно-интронная структура гена,кодирующего фактор элонгации 1-альфа, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
Таблица 8. Экзонно-интронная структура гена,кодирующего белок-рецептор HDEL, в данном фрагменте ДНК киви, найденная при помощи blastx
(*)- экзоны, полученные вручную, путем разбиения. Я разбивала, если встерчался участок, в котором очень много стоп-кодонов и нет достоверного выравнивания с белком (огромное количество гэпов).
Начало
Конец
Цепь
Тип
11507
11605
+
начальный
11943
12044
+
внутренний
12318(*)
12440(*)
+(*)
внутренний(*)
12528(*)
12725(*)
+(*)
внутренний(*)
14213
14326
+
внутренний
14416
14508
+
внутренний
14597(*)
14668(*)
+(*)
внутренний(*)
14789(*)
14893(*)
+(*)
внутренний(*)
20009
20176
+
внутренний
21050(*)
21283(*)
+(*)
внутренний(*)
21365(*)
21454(*)
+(*)
внутренний(*)
23467
23565
+
внутренний
26222(*)
26287(*)
+(*)
внутренний(*)
26387(*)
26470(*)
+(*)
внутренний(*)
26563(*)
26686(*)
+(*)
внутренний(*)
26806(*)
26970(*)
+(*)
внутренний(*)
30196
30309
+
внутренний
30398
30481
+
внутренний
30582(*)
30650(*)
+(*)
внутренний(*)
30759(*)
30860(*)
+(*)
внутренний(*)
31372
31509
+
внутренний
32362(*)
32571(*)
+(*)
внутренний(*)
32656(*)
32733(*)
+(*)
конечный(*)
Начало
Конец
Цепь
Тип
24498
24373
+
начальный
Начало
Конец
Цепь
Тип
72906
73070
+
начальный
73890
74297
+
конечный
Начало
Конец
Цепь
Тип
40396
40590
+
начальный
Начало
Конец
Цепь
Тип
40393
40542
+
начальный
Начало
Конец
Цепь
Тип
72609
73073
+
начальный
73818
74666
+
конечный
(*)- экзоны, полученные вручную, путем разбиения. Я разбивала, если встерчался участок, в котором очень много стоп-кодонов и нет достоверного выравнивания с белком (огромное количество гэпов).
Начало
Конец
Цепь
Тип
94229
94176
-
конечный
94569(*)
94640(*)
-(*)
внутренний(*)
94241(*)
94303(*)
-(*)
внутренний(*)
98666
98544
-
внутренний
100454
100146
-
внутренний
102908
102843
-
внутренний
104038
103943
-
начальный
Вернуться к 3 семестру