| Учебный сайт Софроновой Алины |
| Работу выполнили Кузнецов И. и Софронова А. Данные были взяты с веб-сервиса PePPER и из статьи PePPER: a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons.
PePPER (Prediction of Prokaryote Promoter Elements and Regulons) – веб-сервис, позволяющий предсказывать и искать сайты связывания транскрипционных факторов и регулоны у прокариот.
PePPER способен предсказывать детальную информацию о промоторах, терминаторах, сайты связывания рибосом и транскрипционных факторов. Для поиска регулонов и сайтов связывания транскрипционных факторов данный сервер предлагает инструмент под названием «все в одном» (PePPER all-in-one), схематически представленный на Рис.1. Метод основан на допущении, что регулоны имеют тенденцию к консервативности среди геномов, содержащих ортологичные транскрипционные факторы.
Выбрав регулон на основе транскрипционного фактора из организма, для которого он известен, и один или несколько геномов, в которых хотим найти этот регулон и сайты связывания, программа проводит blast анализ белков выбранного регулона и белков, кодируемых генами нужного нам генома (геномов) – 1a. Параллельно с этим ведется поиск генов, у которых выше по геному встречаются уже известные сайты связывания транскрипционных факторов – 1b. Для генов из этих двух выборок проводится поиск ДНК мотивов (-10 и -35 последовательности, сайт связывания сигма-фактора) выше по геному программой MEME – оставляем гены, для которых этот мотив нашелся - 2. Результат представляется графически.
В качестве входных данных используется просто последовательность ДНК в fasta-формате или полностью аннотированный файл в формате Genebank. Информация об открытых рамках считывания (если таковая отсутствует) автоматически аннотируется программой Glimmer3. Если в качестве исходного файла был файл в формате Genebank, то PePPER выдаст более обширную информацию, включая ссылки на NCBI, такие как аннотации белков, белковые домены и геномное окружение генов.
Промоторы у прокариот ищутся на основе PWM (позиционная матрица весов) -10 и -35 консенсусных последовательностей и различных сайтов связывания сигма-фактора. PWM PePPER берет из базы данных RegulonDB (E. coli) для поиска в Грамм-отрицательных бактериях и DBTBS (B. subtilis) для Грамм-положительных. Сайты связывания рибосом ищутся программой RBSfinder.
Оперон walRKyycHIJK в бактерии B. Subtilis – шестицистронный оперон, который среди прочего кодирует систему WalRK, контролирующую экспрессию 23 генов. Эти гены входят в один регулон – WalR – крайне важный для метаболизма клеточной стенки. Наличие этого регулона никогда не было ранее описано для бактерии Lactococcus lactis. Было решено провести поиск данного регулона для 4 различных штамов L. lactis при помощи PePPER. В итоге было обнаружено, что продукты 4 генов walRKyycHIJK бактерии B. subtilis ортологичны kinC, llrC и vicX, htrA бактерии L. lactis штамм MG1363 (Таблица 3).Более того, PePPER показал, что 13 из 23 белков регулона WalR у B. subtilis имеют высокую схожесть (Blast e-value <10е-20) с белками L. Lactis MG1363 (Таблица 2). Используя инструмент PePPER multiple genome mining, ясно, что ортологи WalRK и часть генов регулона WalR бактерии B. subtilis представлены во всех других полных последовательностях штаммов L. lactis: IL1403, SK11 and KF147 (Таблица 3).
Streptococci филогенетически близки к Lactococci и, таким образом, возможен анализ WalRK регулонов в обоих группах при помощи PePPER toolbox. Результаты (Рис. 2) известных WalRK регулонов (B. subtilis, S. pneumoniae, Staphylococcus aureus) с предсказанными регулонами Lactococci и Streptococci. Регулон B. subtilis (Рис. 2a) показал высокую консервативность между двумя группами, где 6 генов не были найдены, а 9 генов из 23 были найдены для всех видов (protein blast e-value 10е-20). Различие между двумя группами показано на Рис. 2b, где 11 из 24 генов регулона S. pneumoniae R6 WalRK не были найдены у Lactococci.
Сайт связывания WalR (TGTAA-n6-TGTAA) был найден экспериментально (при помощи футпринтинга ДНК) для 4 организмов: B. subtilis, Staph. aureus, S. pneumoniae и S. mutans. Был составлен мотив для регулона WalR на основе сайтов связывания для этих 4 бактерий. Далее, при помощи PePPER, был проведен скрининг генома L. lactisstrains на наличие этого мотива. Вышерасположенные по геному участки двух генов бактерии L. Lactis MG1363, которые ортологичны генам регулона WalRK, содержит данный мотив. Вышележащие области остальных ортологов оперона WalRK мотив не содержат. Интересно, что анализируемый мотив (Рис. 3) присутствует в области гена acmA, который является гидролазой клеточной стенки, что может показывать, что этот ген может регулироваться WalRK и что ответ системы WalRK на стресс у L. lactis так же может повлиять на их экспрессию. Вернуться к 4 семестру |
| © Алина Софронова, 2015 Дата последнего изменения: 12.03.2015 |