Цель данного задания было (1) проверить корректность предсказания сервиса TMHMM и (2) проверить консервативность различных частей трансмембранных белков.
Для данного практикума был выдан человеческий белок (цепь D) двупорового калиевого канала TREK2 (индентификатор в базе данных pdb - 4XDL). Для него была составлена репрезентативная выборка при помощи PSI-BLAST. Поиск проводился в базе данных RefSeq по трем доменам Bacteria (6 находок), Archaea (9 находок), Eukaryotes (за исключением типа Chordata - 6 находок), находки имеют E-value ~ 1e-5 - 1e-10). Были выбраны организмы из различных далеких систематических групп. Файл с последовательностями в fasta-формате можно посмотреть здесь.
При помощи алгоритма Muscle было построено множественное выравнивание, которое визуализирова на Рис.1. Была использована раскраска Hydrophobicity с консервативностью 5%: синий цвет - гидрофильные аминокислоты, красный - гидрофобные.
Рис.1. Множественное выравнивание белков из репрезентативной выборки для выданного белка. Выравнивание получено с помощьюпрограммы Muscle. Рисунок получен с помощью программы Jalview, раскраска Hydrophobicity, консервативность 5%.
Так как белки брались из разных организмов, то неудивительно, что выравнивание получилось не достоверным - много гэпов и мало консервативных участков (один четко выраженный участок - 365-372). На основе этого выранивания было получено изображение исходного белка (Рис.2), так что цвет на структуре белка совпадает с таковым в выравнивании, причем его часть, ориентированная в n-сторону мембраны оказалась сверху, а ориентированная в p-сторону - снизу.
Справа от него на Рис.3 изображен также исходный белок, но покарашенный на основе гидрофильности-гидрофобности его аминокислот.
 |
 |
| Рис.2 Изображение исходного белка. Цвет соответсутвует приведенному выше выравниванию. | Рис.3 Изображение исходного белка. Цвет не зависит от выравнивания и строится только на основе гидрофильности и гидрофобности аминокислот: синий - гидрофильный остаток, красный - гидрофобный. |
На Рис.3 можно четко проследить какие спирали относятся к трансмембранным какие нет. Гидрофильные участки (синие) в большом количестве сосредоточены внизу белка (в межклеточном пространстве) и слегка затрагивают верхнюю часть (внутриклеточное пространство). Между n- и p-стороной мембраны сосредочены гидрофобные участки - на рисунке они изображены красным цветом, что действительно подтверждает трансмембранность белка.
Для выданного белка (верхняя строка выравнивания) были отмечены символом "М" в строке TM_REAL аминокислоты, принадлежащие к трансмембранным спиралям. Заключение о том, является ли спираль трансмембранной или нет делался на основе базы данных ОРМ.
Далее для одного из гомологов (вторая строчка выравнивания - последовательность в fasta-формате) было добалено к выравниванию предсказание трансмембранных спиралей, выдаваемых программой TMHMM - символ "М" в строке TM_PREDICTED.
Некоторые консервативные участки, которые присутствуют в выравнивании и отмечены цветом на белке, принадлежат к трансмембранным спиралям. Но подавляющее большинство аминокислотных остатков, встречающихся в трансмембранных спиралях, не консервативны. Безусловно в них доминируют гидрофобные аминокислоты: валин, фенилаланин, аланин, изолейцин, лейцин. Пожалуй самый консервативный из всех участков принадлежит участку между спиралями. Что касается гидрофильных участков в транмембранных спиралях, то это явление в данном случае выражено слабо. Среди консервативных участках встречаются только полярные незаряженные аминокислоты: тирозин и особенно треонин. Возможно их присутствие связано с функцией белка, как калиевого насоса - полярные аминокислоты принадлежат калий-связывающим сайтам внутри канала и помогают стабилизировать ионы калия.
Сопоставим результаты программы TMHMM и реальной структурной информации (будем учитывать только перекрывающие участки последовательностей). В итоге TMHMM в одном месте из двух излишне предсказала трансмембранную спираль (20-42 аминокислоты относительно последовательноти белка-гомолога), зато вторую смогла предсказать достаточно точно (394-414 аминокислоты в общем выравнивании). Также программа TMHMM не смогла предсказать еще одну спираль. Такие несовпадения возникли из-за малых участков перекрывания исходного белка и гомолога, а так же из-за далекого родства организмов, к которым принадлежат эти белки (человек и прокариотный организм).
Вернуться к 4 семестру