Атлас контактов

Рибонуклеаза III - фермент, специфичный к двухцепочечным РНК (дцРНК). Принадлежит классу рибонуклеаз эндонуклеаз: гидролизует фосфодиэфирную связь в специфичных участках последовательности Рнк. Участвует в преобразовании дцРНК в матричную РНК, регуляции экспрессии генов, защите от вирусной инфекции, а также в саморегулируемом механизме полинуклеотидного фосфорилирования (pnp autoregulatory mechanism). Встречается в клетке повсеместно.^[1]

Белок, являющийся предметом нашего исследования, выделен из Пекарских дрожжей (S. cerevisiae). Является Mg2+ зависимым. Четвертичная структура является димерной (представляет собой 2 субъединицы). В каждой субъединице белка имеются три домена: один домен Rnt1p, принадлежащий первому классу суперсемейства rnase3 (гидролизует фосфодиэфирную связь, участвует в опознавании специфичного участка РНК) и два домена dsRNA-binding domain (dsRBD) (участвуют в связывании субстрата на время гидролиза).^[2]

В данном комплексе присутствует только один лиганд: этиленгликоль. В файле pdb данного комплекса были найдены атомы, не относящиеся ни к белку, ни к РНК. (HETATM). Помимо этиленгликоля, таким образом был помечен и видоизмененный остаток (5'-O-[(DITHIOPHOSPHONO)]CYTIDINE).

Этиленгликоль (гликоль; 1,2-диоксиэтан; этандиол-1,2), HO—CH₂—CH₂—OH — двухатомный спирт, простейший представитель полиолов (многоатомных спиртов). В очищенном виде представляет собой прозрачную бесцветную жидкость слегка маслянистой консистенции. Не имеет запаха и обладает сладковатым вкусом. Токсичен. ^[3]

К ковалентным связям в белке относят:

- пептидные. Пептидная связь — вид амидной связи, возникающей при образовании белков и пептидов в результате взаимодействия α-аминогруппы (—NH2) одной аминокислоты с α-карбоксильной группой (—СООН) другой аминокислоты. Из двух аминокислот (1) и (2) образуется дипептид (цепочка из двух аминокислот) и молекула воды. По этой же схеме рибосома генерирует и более длинные цепочки из аминокислот: полипептиды и белки. Разные аминокислоты, которые являются «строительными блоками» для белка, отличаются радикалом R.^[4] Так как этот вид ковалентной связи является основой в образовании линейной (первичной) структуры белков, то для демонстрации ее были рандомно выбраны два остатка.

- дисульфидные мостики. Третичную структуру некоторых белков стабилизируют дисульфидные связи, образующиеся за счёт взаимодействия SH-групп двух остатков цистеина. Эти два остатка цистеина могут находиться далеко друг от друга в линейной первичной структуре белка, но при формировании третичной структуры они сближаются и образуют прочное ковалентное связывание радикалов.^[5] В исследуем комплексе не было обнаружено ни одного дисульфидного мостика (все остатки цистеина расположены очень далеко друг от друга, что, естественно, говорит о том, что никакой связи между ними нет).

Для того чтобы сохранить текущее изображение в формате png, нажмите кнопку "Save image".

Водородная связь — форма ассоциации между электроотрицательным атомом и атомом водорода H, связанным ковалентно с другим электроотрицательным атомом. В качестве электроотрицательных атомов могут выступать N, O или F. Водородные связи могут быть межмолекулярными или внутримолекулярными.^[6] В белках водородные связи возникают между гидрофильными незаряженными группами (такими как -OH, -CONH₂, SH-группы) и любыми другими гидрофильными группами. В белках присутствуют такие структуры, как α-спирали и β-тяжи. В α-спиралях пептидный остов закручивается в виде спирали за счет образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп, входящих в состав пептидных групп через 4 аминокислотных остатка. β-тяжи формируются за счет образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями. β-структура обрузует фигуру, подобную листу, сложенному "гармошкой", - β-складчатый слой.^[7] Для того чтобы обнаружить эти структуры в составе данного комплекса, были найдены координаты этих структур (HELIX и SHEET соответственно) в файле pdb, затем эти структуры были открыты в локальном jMol, и с помощью команды calculate hbonds на экран были выведены водородные связи в этих структурах. С помощью инструмента Measurements были измерены расстояния между атомами, участвующими в образовании связей, а также углы N-O-C. Оказалось, что в среднем длина водородной связи равна трем ангстремам, а угол - примерно 150 градусов. Конечно, данная величина намного меньше заявленной в литературе^[8], однако, это можно объяснить наличием других видов связи в данном комплексе, и в белке в частности. Слева расположен апплет, демонстрирующий строение α-спирали и β-тяжей. Для того чтобы начать, нажмите кнопку "Start script", чтобы посмотреть следующее изображение - "Resume", сохранить текущее изображение в формате png - "Save image", вернуться к начальному изображению - "Reset". (ссылка на скрипт) В таблице ниже приведены некоторые количественные данные, характеризующин эти структуры.

Солевые мостики (ионная связь) образуются в результате взамодействия между отрицательно заряженными (анионными) карбоксильными группами радикалов аспарагиновой (Asp) и глутаминовой (Glu) кислот и положительно заряженными (катионными) группами радикалов лизина (Lys), аргинина (Arg) или гистидина (His)^[9] . Для поиска солевых мостиков был использован сервис P I C^[10], который на выходе дает документ со всеми найденными ионными связями в исходном комплексе. Также солевые мостики находились и с помощью локального Jmol следующим образом: из окна командой "restrict negative" убираются все, кроме отрицательно заряженных остатков, затем командой "select within(group, positive and within(3.5, negative))" на экран выводятся все положительно заряженные остатки, которые находятся на расстоянии не больше трех ангстрем. (предварительно отрицательные раскрашиваюся по цепям, положительные выводятся на экран, например с меньшим cpk, и тоже раскрашивается по цепям). Затем глазами находится наиболее привлекательный контакт. (ссылка на скрипт)

Термин стэкинг в супрамолекулярной химии относится к такому расположению ароматических молекул, которое напоминает расположение монет в стопке и поддерживается ароматическими взаимодействиями. Наиболее популярный пример такого расположения наблюдается в последовательных парах оснований ДНК. Стэкинг также часто наблюдается в белках, когда два относительно неполярных кольца имеют перекрывающиеся π-орбитали. Точная природа таких взаимодействий (электростатическая или неэлектростатическая) остаётся предметом обсуждений. ^[11] Стэкинг относится к нековалентным взаимодействиям между ароматическими кольцами. Эти взаимодействия важны для укладки азотистых оснований в ДНК и РНК. Существует несколько видов расположения ароматических колец в пространстве:

- в виде сэндвича, когда кольца располагаются одно под другим;

- в виде буквы "Т", когда кольца располагаются перпендекулярно относительно друг друга;

- параллельно-смещенное.

Дя поиска данного вида связи был также использован сервис P I C. Слева расположен апплет, демонстрирующий данный тип связи. (ссылка на скрипт)

Растворение в воде гидрофобных веществ приводит к значительному снижению энтропии из-за того, что молекулы воды, находящиеся в непосредственной близости от неполярной молекулы, фиксируются в определённом положении и формируют высокоупорядоченную оболочку вокруг растворённого вещества. Такое положение термодинамически невыгодно системе, поэтому молекулы гидрофобных веществ в воде вступают в гидрофобные взаимодействия: силы, удерживающие вместе неполярные группы молекул растворённого вещества и не связанные с внутренним притяжением между неполярными остатками ^[12].

Как правило, в белках гидрофобное ядро состоит исключительно из гидрофобных боковых цепей. Оно компактно, зачастую погружено внутрь глобулы. Гидрофобное ядро окружено наружной оболочкой, имеющей контакт с водой. Часто эта оболочка имеет мозаичный характер: в ней чередуются гидрофильные и гидрофобные участки, что имеет функциональное значение: гидрофобные участки могут формировать зоны связывания с субстратом, участвовать в белок-белковых взаимодействиях. Гидрофобные ядра играют важную роль в стабилизации третичной структуры белка. Гидрофобные взаимодействия участвуют в создании четвертичной структуры белка: в сочетании с водородными связями между субъединицами они делают четвертичную структуру, с одной стороны, прочной и стабильной, и, с другой стороны, достаточно гибкой, что является очень важным для функциональности многих белков^[13].

Для поиска гидрофобных ядер был использован сервис CluD^[14].

При нажатии на кнопку "Show cores" вы можете увидеть гидрофобные ядра данного белка (ядро 4 - зелёное, ядро 46 - фиолетовое)

При нажатии на кнопку "Resume" вы можете увидеть выходы гидрофобных ядер на поверхность белковой глобулы (молекулы белка, не относящиеся к гидрофобным ядрам - серые).

Чтобы сохранить изображение, нажмите на кнопку "Save image".

Чтобы вернуться к исходному состоянию, нажмите на кнопку "Reset".

Ссылка на скрипт

Доменами в белках называют области в третичной стуктуре, которым свойственна определённая автономия структурной организации. В рамках биологической функции данного белка домены нередко (как и в нашем случае) выполняют собственные задачи. И тогда структурная автономия домена дополняется функциональной. Наличие доменов создаёт структурные предпосылки для большей, чем в рамках единой пространственной структуры, внутренней гибкости, динамики белковой молекулы, достигаемой смещением доменов относительно друг друга. Зоны междоменных контактов представляют собой в первом приближении впадины, что облегчает размещение участков специфического связывания белком субстрата.^[15]

Как было отмечено выше, в изучаемом нами белке именно домены играют ключевую роль в его биологических функциях, поэтому представляется интересным изучение некоторых взаимодействий в доменах и их контакты с РНК.

При нажатии кнопки "Show domains" вы можете увидеть 3 домена: один (окрашенный красным) - домен rnase3 Rnt1p, два других (окрашенные в синий) - домены dsrbd (см. введение).

При нажатии кнопки "rnase3 and covering hydrophobic contacts" вы можете увидеть гидрофобные участки домена rnase3 Rnt1p (оранжевые шарики) и гидрофобные участки окружающей его оболочки белка (зелёные шарики), находящиеся на расстоянии не более     10 Å от домена, в виде Ван-дер-Ваальсовых радиусов. Благодаря cpk-изображению хорошо видно гидрофобное взаимодействие между некоторыми гидрофобными участками домена и окружающей его белковой оболочки. Роль этого взаимодействия состоит в стабиизации третичной структуры белка, "закреплении" этого домена в данном белковом комплексе.

При нажатии кнопки "dsrbd and covering hydrophobic contacts" вы можете увидеть гидрофобные участки доменов dsrbd (фиолетовые шарики) и гидрофобные участки окружающей их оболочки белка (зелёные шарики), находящиеся на расстоянии не более 10 Å от доменов, в виде Ван-дер-Ваальсовых радиусов. Аналогично домену rnase3, хорошо видно гидрофобное взаимодействие между некоторыми гидрофобными участками доменов и окружающей их белковой оболочки, роль которго также сводится к стабиизации третичной структуры белка.

Также хорошо видно, что не все гидрофобные участки доменов ориентированы в сторону белковой оболочки. Подробнее об этом смотрите ниже.

При нажатии кнопки "dsrbd and rna" вы можете увидеть гидрофобные участки доменов dsrbd и основания в РНК в виде Ван-дер-ваальсовых радиусов. Cpk-модель позволяет увидеть, что те гидрофобные части домена dsrbd, которые не вовлечены в гидрофобное взаимодействие с белковой оболочкой, обращены внутрь бороздки РНК, из чего можно предположить, что между данными частями и основаниями РНК существует гидрофобное взаимодействие (т.к. основания РНК являются гидрофобными). Гидрофобное ядро домена dsrbd играет важную роль при опознавании субстрата^[16], а также участвует в удержании субстрата на время гидролиза.

При нажатии кнопки "rnase3 and rna" вы можете увидеть гидрофобные участки домена rnase3 и основания в РНК в виде Ван-дер-ваальсовых радиусов. Cpk-модель позволяет увидеть, что, в отличие от домена dsrbd, лишь некоторые гидрофобные участки, не вовлечённые в гидрофобное взаимодействие с белковой оболочкой, взаимодействуют с гидрофобными основаниями РНК, и расположены они "по краям" данного домена. Большой интерес вызывает "впадина", расположенная в центре rnase3. Благодаря сpk-изображению мы видим большое скопление гидрофобных остатков в этой "впадине", что позволяет предположить, что это - гидрофобный карман. Согласно статье^[2], здесь находится каталитический центр, в котором важную роль играют атомы магния 2+. К сожалению, авторы статьи не разместили этот лиганд в pdb-файле, поскольку он не являлся предметом их изучения. Однако нам известно, что для опознавания субстрата и ферментативной активности домена rnase3 ион магния 2+ должен находиться в строго определённой конформации^[17], в связи с чем можно предположить, что такое количество гидрофобных остатков в кармане играет значительную роль в расположении атомов магния в необходимой конформации.

Так как в данном комплексе в качестве лиганда присутствует только этандиол-1,2, имеющий две гидроксильные группы (-OH), то можно предположить, что он может быть задействован в образовании водородной связи. С помощью команды select within были найдены атомы кислорода, находящиеся на расстоянии не далее, чем на три с половиной ангстрема от молекулы этандиола (ligand). Одним из таких атомов был атом кислорода (CO) глутаминовой кислоты ([GLU]138:f). Длина водородной связи 2.68 ангстрема

В ходе исследования было обнаружено, что данный лиганд никак не взаимодействует с РНК: с помощью команды within были выведены атомы РНК, находящиеся не далее, чем на 4 ангстрема от лиганда, и, как оказалось, туда попало два атома кислорода, только один из которых мог бы образовать связь с лигандом. Однако, расстояние между этим атомом и атомом кислорода составило 3.88 ангстрема, что свидетельствует о том, что связи между ними нет (максимальная длина водородной связи составляет 3 ангстрема).

Слева расположен апплет, демонстрирующий данный вид связи. Для того чтобы сохранить картинку в формате png, нажмите "Save image". (ссылка на скрипт)

Анастасия Титова: дизайн сайта, разделы: Описание низкомолекулярных лигандов в составе комплекса; Ковалентные связи; Водородные связи; Солевые мостики; Стэкинг-взаимодействие; Информация о лиганд-биомолекулярных контактах.

Александр Морозов: разделы: Введение; Гидрофобные ядра; Домены.

[1]: Wikipedia. Ribonuclease III

[2]: He Song, Xianyang Fang, Lan Jin, Gary X. Shaw, Yun-Xing Wang, Xinhua Ji (2017). The Functional Cycle of Rnt1p:

        Five Consecutive Steps of Double-Stranded RNA Processing by a Eukaryotic RNase III. Structure 25, 353-363;

[3]: Википедия. Этиленгликоль;

[4]: Википедия. Пептидная связь;

[5]: Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 26-27 стр.

[6]: Водородная связь. Википедия;

[7]: Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 23-25 стр.

[8]: Д. Нельсон, М. Кокс. "Основы биохимии Ленинджера", Изд.:"Лаборатория знаний", Москва, 2017, т.1, стр.:77, 177-183.

[9]: Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. 23-25 стр.

[10]: P I C : Protein Interactions Calculator;

[11]: Стэкинг. Словари и энциклопедии на Академике.

[12]: Д. Нельсон, М. Кокс. "Основы биохимии Ленинджера", Изд.:"Лаборатория знаний", Москва, 2017, т. 1, стр.:81;

[13]: В. М. Степанов "Молекулярная биология. Структура и функции белков", Изд.:"Наука", Москва, 2005, стр.:111-114, 156-157;

[14]: Сервис CluD;

[15]: В. М. Степанов "Молекулярная биология. Структура и функции белков", Изд.:"Наука", Москва, 2005, стр.:121-122;

[16]: Elon Hartman†, Zhonghua Wang†, Qi Zhang, Kevin Roy, Guillaume Chanfreau, Juli Feigon (2013). Intrinsic Dynamics of

        an Extended Hydrophobic Core in the S. cerevisiae RNase III dsRBD Contributes to Recognition of

        Specific RNA Binding Sites. Journal of Molecular Biology, Volume 425, Issue 3, 546–562;

[17]: Wei Yang, Jae Young Lee, Marcin Nowotny (2006). Making and Breaking Nucleic Acids: Two-Mg2+-Ion Catalysis and

        Substrate Specificity. Molecular Cell, Volume 22, Issue 1, p5–13.