Standalone BLAST

Поиск некодирующих РНК (misc_RNA), аннотированных в одном штамме, в геноме другого штамма

С FTP-сервера NCBI скачан файл NC_000964.frn, содержащий последовательности всех аннотированных РНК штамма Bacillus_subtilis_168_uid57675, из этого файла с помощью команды "infoseq NC_000964.frn | grep 'misc_RNA' | awk '{ print $1 }' > usa.txt" получен файл-список usa.txt, содержащий универсальные адреса (USA) всех некодирующих РНК. Наконец, с помощью команды "seqret @usa.txt misc_rna.fasta" получен файл misc_rna.fasta, содержащий все некодирующие РНК штамма Bacillus_subtilis_168_uid57675.

Затем с того же FTP-сервера NCBI скачаны файлы NC_016047.fna и NC_016047.gbk, содержащие геном Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967 (другого штамма этой же бактерии). На основе генома этого штамма с помощью команды "makeblastdb -in NC_016047.fna -dbtype nucl" создана нуклеотидная база данных локального BLAST-а в виде трёх файлов: NC_016047.fna.nhr, NC_016047.fna.nin и NC_016047.fna.nsq.

Далее с помощью алгоритма megablast произведён поиск misc_RNA штамма Bacillus_subtilis_168_uid57675 в геноме Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967 с помощью команды: "blastn -task megablast -query misc_rna.fasta -db NC_016047.fna -out blast1.out -outfmt 7 -num_alignments 1".

В результате получен файл blast1.out, содержащий информацию о находках и на его основе составлена таблица, в которой для каждой misc_RNA указан номер, цепь (прямая или обратная на основе записи RefSeq; информация о цепи взята из соответствующего Bacillus_subtilis_168_uid57675 *.gbk файла), а также координаты начала и конца лучшего найденного гомолога. Полученную таблицу можно скачать здесь.

Поиск гомологов РНК Bacillus subtilis в геноме другой бактерии

Произведен поиск гомологов некодирующих РНК Bacillus_subtilis_168_uid57675 в геноме Bacillus_cereus_biovar_anthracis_CI_uid50615.

На FTP-сервере NCBI штамму Bacillus_cereus_biovar_anthracis_CI_uid50615 соответствует 4 файла в формате *.fna. Один из них (NC_014335.fna) содержит последовательность кольцевой хромосомы, а файлы NC_014331.fna, NC_014332.fna и NC_014333.fna соответствуют плазмидам. Т.к. полный геном бактерии включает в себя и плазмиды в том числе, для дальнейшего запуска BLAST создан общий файл B_cereus_biovar.fna, содержащий все 4 последовательности.

Далее на основе файла B_cereus_biovar.fna создана нуклеотидная база данных тремя способами и произведён поиск гомологов:

с помощью алгоритма megablast (команда "blastn -task blastn -query misc_rna.fasta -db B_cereus_biovar.fna -out blast2_bn0.out -outfmt 7 -num_alignments 1 -evalue 0.001")
с помощью алгоритма blastn с параметрами по умолчанию (команда "blastn -task megablast -query misc_rna.fasta -db B_cereus_biovar.fna -out blast2_m0.out -outfmt 7 -num_alignments 1 -evalue 0.001")
с помощью blastn c измененными параметрами: длина слова = 4, награда за совпадение = 1, штраф за несовпадение = –1 (команда "blastn -task blastn -query misc_rna.fasta -db B_cereus_biovar.fna -out blast2_bn1.out -outfmt 7 -num_alignments 1 -word_size 4 -reward 1 -penalty -1 -evalue 0.001")

Т.к. нам интересны только находки с e-value меньше 0.001, во всех трёх случаях выставлен порог на e-value (с помощью опции -evalue 0.001). Полученные файлы с находками: blast2_m0.out, blast2_bn0.out, blast2_bn1.out.

Затем произведён подсчёт находок с e-value меньше 0.001 для каждого запуска blast, результаты оформлены в форме таблицы, которую можно скачать здесь.

Поиск неправильно аннотированных генов программой blastx

С FTP-сервера NCBI скачаны последовательности предсказанных белков штамма Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967 (файл NC_016047.faa). На основе этого файла создана белковая база данный локального BLAST-а (команда "makeblastdb -in NC_016047.faa -dbtype prot").

С помощью программы blastx, которая в качестве query принимает файл с нуклеотидными последовательностями, но производит поиск по белковой базе данных, был произведён поиск гомологов некодирующих РНК Bacillus_subtilis_168_uid57675 среди предсказанных белков Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967. Выставлен порог e-value (меньше 0.001). Использовалась команда "blastx -query misc_rna.fasta -db NC_016047.faa -out blastx.out -outfmt 7 -num_alignments 1 -evalue 0.001". Полученный файл с находками - blastx.out.

Гомологи нашлись для misc_RNA под номерами 1, 25, 41, 46, 53, 57, 58, 61, 62. Почти все найденные гомологи оказались гипотетическими ("предполагаемыми") белками, кроме гомолога 1-ой misc_RNA (гомологичный белок - серил-тРНК синтаза) и 46-ой (гомолог - аспартокиназа).

Cхема генома в интересном месте

Составлены карты генов Bacillus_subtilis_168_uid57675 и Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967 в окрестности участка с координатами 20042-23842. Выровненные карты генов можно увидеть здесь.

На последовательность BSU_misc_RNA_1 Bacillus_subtilis_168_uid57675 накладываются последовательности гена из локуса GYO_0016 и гена serS штамма Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967. В прошлом задании blastx определил последовательность гена serS (кодирующего серил-тРНК синтазу) как гомологичную первой некодирующей РНК. Видимо так произошло, потому что последовательность из генома Bacillus_subtilis_spizizenii_TU_B_10_uid73967, гомологичная первой некодирующей РНК Bacillus_subtilis_168_uid57675, находилась рядом с последовательностью гена serS и её по ошибке аннотировали как кодирующую реальный белок.

Зависимость времени работы blastn от длины затравки

Проанализирована зависимость времени работы blastn от длины затравки на примере поиска гомологов некодирующих РНК Bacillus_subtilis_168_uid57675 в геноме Bacillus_cereus_biovar_anthracis_CI_uid50615. Использовалась команда "time blastn -task blastn -query misc_rna.fasta -db B_cereus_biovar.fna -out test.blastn -word_size x", где x - целое число в диапазоне от 4 до 16. Информация о времени работы blastn в зависимости от длины затравки представлена на таблице 1. Графическое представление зависимости можно увидеть на рис. 1.

Таблица 1. Зависимость времени работы blastn от длины затравки

Длина затравки	Время работы blastn (в секундах)
4	82,909
5	21,596
6	6,13
7	2,277
8	1,277
9	1,121
10	0,894
11	0,827
12	0,767
13	0,751
14	0,732
15	0,707
16	0,656

Рис. 1. Графическое представление зависимости времени работы blastn от длины затравки. По оси абсцисс отложена длина затравки, по оси ординат - время в секундах.

Видно, что при увеличении длины затравки время, затрачиваемое на поиск гомологов, уменьшается.