1. Введение






Получение лизина




В зависимости от назначения из КЖ можно получить различные микробиологические препараты: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ), кристаллический лизин.



Кристаллический лизин выделяют из КЖ после отделения биомассы.

Для получения кормовых продуктов пригодны препараты лизина с содержанием основного вещества (лизинмонохлоргидрата) от 70 % и выше. При этом допускается окраска кристаллов в желтый и светло-коричневый цвета. К препаратам медицинского назначения предъявляются более жесткие требования; для парентерального питания содержание основного вещества должно быть не ниже 99 %.

При нормальном течении процесса доля побочных аминокислот не превышает 3 % от содержания лизина, доля микробных клеток — 1,5 %. Для отделения биомассы от КЖ используют саморазгружающиеся сепараторы, а также фильтрование с намывным слоем либо на барабанном вакуум-фильтре, либо на рамных фильтр-прессах с последующей промывкой осадка водой.

Растворы, содержащие лизин, после подкисления соляной кислотой (рН = 5,0÷5,2) и введения стабилизатора (NaHSO3) концентрируют выпариванием в вакууме до 45–50 % СВ. Полученный концентрат подвергают кристаллизации, которую проводят при 5–12 °С в течение 1–2 сут. Осадок отделяют от маточника в проточных промышленных центрифугах и далее высушивают в распылительной сушилке или в кипящем слое. Готовый продукт, как правило, окрашен в коричневый цвет и содержит не менее 70 % основного вещества.

Другим способом выделения лизина является ионообменный процесс. Для этого раствор продукта подкисляют H2SO4 до рН = 1,6÷2,0, в результате чего образуется дикатион аминокислоты. После хемосорбции на катионите (КУ-2х8), используемом в Н+ или форме, отделяются примеси нейтральной и кислотной природы. Аминокислоты элюируют из катионита 0,5–5 % гидроксида аммония, раствор упаривают, подкисляют HCl до рН = 4,9÷5,0, а концентрат кристаллизуют при 5–12 °С, получая кристаллы монохлоргидрата лизина светло-желтого или светло-коричневого цвета, которые после высушивания содержат 90–95 % основного вещества и 1,0–12,5 % золы. Для получения препарата более высокой степени чистоты в схему очистки включают стадию обработки раствора активным углем, перекристаллизацию из 50% этанола и др.

Энзиматический синтез L-лизина

Производство L-лизина посредством энзиматического синтеза основано на предварительном химическом синтезе DL-α-амино-ε-капролактама (АКЛ), который далее используют для селективного ферментативного гидролиза L-АКЛ до L-лизина; D-АКЛ подвергается ферментативной рацемизации и вновь используется как субстрат для гидролиза. Гидролизующий фермент получают из клеток Cryptococcus laurendii, а фермент, катализирующий рацемизацию, — из клеток Achromobacter obae. При получении L-лизина целесообразно использовать совместное действие на субстрат двух ферментов. Для этого в водный раствор DL-α-амин-ε-капролактама вводят необходимое количество дрожжевых и бактериальных клеток, проявляющих гидролазную и бактериальную активности. Оптимальные условия для действия обоих ферментов следующие: рН = 8,0÷8,5; температура 30–50 °С. Выход L-лизина в этом процессе составляет 99,8 % (мольных) от субстрата [⁶] .

По химическим свойствам лизин – α-аминокислота с сильными основными свойствами, обусловленными ε-аминогруппой. С кислотами дает два ряда солей, например с соляной кислотой – гидрохлорид и дигидрохлорид. Образует нерастворимые соли с пикриновой и фосфорномолибденовой кислотами.




Кривая титрования




Далее можно видеть визуализацию форм лизина в соответствие с данными, полученными при титровании

SEE TEXT OF THE SCRIPT

SEE TEXT OF THE SCRIPT

SEE TEXT OF THE SCRIPT




2. Метаболические пути

Биосинтез

Лизин - незаменимая аминокислота, т.е. в организме человека лизин не синтезируется, поэтому он должен поступать с пищей. У растений и большинства бактерий лизин образуется из аспарагиновой кислоты через диаминопимелиновую кислоту (ДАП-путь). Сначала происходит фосфорилирование L-аспарагиновой кислоты с образованием L-аспартил-4-фосфата и восстановление аспартилфосфата до аспартил-4-семиальдегида. Эти же реакции происходят на начальных этапах биосинтеза треонина, изолейцина и метионина. Последующая конденсация пирувата и аспартил-4-семиальдегида с образованием дигидродипиколината является первой реакцией, специфической для биосинтеза лизина. Дальнейшие превращения, следующие за восстановлением дигидропиколината до тетрагидродипиколината (ТГДП), могут происходить по-разному:

А. Сукцинилазный путь. У большинства бактерий происходит сукцинилирование ТГДП и образуется N-сукцинил-2-амино-6-кетопимелат.

Б. Ацетилазный путь. Некоторые бактерии рода Bacillus вместо сукцинильной группы используют ацетильную и соответственно продуктом реакции является N-ацетил-2-амино-6-кетопимелат.

В. Дегидрогеназный путь. Немногие бактерии способны к превращению ТГДП сразу в мезо-диаминопимелат благодаря наличию фермента ДАП-дегидрогеназы.

В случае сукцинилазного и ацетилазного путей после ацилирования следуют реакции аминирования (с образованием N-ацилдиаминопимелата, где в качестве ацила выступает либо сукцинил, либо ацетил), деацилировании и эпимеризации образовавшейся LL-ДАП в мезо-диаминопимелат.

Схема сукцинилазного пути представлена ниже.



Схема сукцинилазного пути биосинтеза лизина через диаминопимелиновую кислоту




Катаболизм

Лизин – кетогенная аминокислота, т.е. она может превратиться в печени в кетоновые тела – β-гидроксибутират, ацетон, ацетоацетат. Деградация лизина в организме человека включает в себя несколько стадий:

1) конденсация лизина и α-кетоглутарата с образованием шиффова основания, которое восстанавливается до L-сахаропорина

2) окисление L-сахаропорина до L-2-аминоадипата через стадию семиальдегида

3) трансаминирование L-2-аминоадипата с α-кетоглутаратом, приводящее к образованию 2-оксоадипата

4) окислительное декарбоксилирование 2-оксоадипата с образованием ацетил-КоА

При мутации в гене α-аминоадипатсемиальдегидсинтазы (AASS) – фермента, катализирующего первые две стадии катаболизма (окисление до семиальдегида), возникает гиперлизинемия, приводящая к повышению содержания лизина в крови и в моче. При соблюдении диеты заболевание не имеет серьезных последствий.



Схема деградации лизина [2]




Роль в метаболизме

Лизин играет важную роль во взаимодействии различных белков (например, гистонов) с ДНК благодаря электростатическим взаимодействиям положительно заряженной ε-аминогруппы и отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты в ДНК. Он также необходим для биосинтеза карнитина – вещества, участвующего в переносе жирных кислот через мембраны митохондрий.

Лизин может посттрансляционно подвергаться различным модификациям, например:

а) ацетилирование и метилирование (эти модификации лизина в гистонах играют важную роль в регуляции доступности ДНК для ферментов транскрипции)

Здесь можно посмотреть водородные связи эпсилон-амино-группы лизина с ДНК. У лизина это единственно возможная связь с ДНК in vivo. Ацетилирование этой группы приводит к тому, что модифицированный остаток не может образовывать водородную связь. Апплет расположен ниже.

N-ацетил-лизин

Ацетилирование гистонов играет важную роль в модуляции структуры хроматина при активации транскрипции, увеличивая доступность хроматина для транскрипционного аппарата. Известно что ацетилированные гистоны признак транскрипционно активного хроматина. Но является ли ацетилирование причиной или следствием активации транскрипции? Сейчас более склонны думать, что это одна из причин. Гистоны целенаправленно модифицируются на тех промоторах, которые требуется активировать. При этом определенные остатки лизинов подвергаются ацетилированиям и деацетилированиям с помощью ферментов ацетилтрансфераз и деацетилаз .Полагают, что ацетилированные гистоны менее прочно связаны с ДНК и поэтому транскрипционной машине легче преодолевать сопротивление упаковки хроматина. В частности ацетилирование может облегчать доступ и связывание факторов транскрипции к их элементам узнавания на ДНК. Сейчас идентифицированы ферменты, которые осуществляют процесс ацетилирования и деацетилирования гистонов, и, наверное, скоро мы узнаем больше о том, как это увязывается с активацией транскрипции. В дрожжах с процессами ацетилирования гистонов связан сложный ацетилтрансферазный комплекс SAGA.

В него входит более 20 различных белков, в том числе и гистоноподобные TAF . Уровень ацетилирования необходимый для облегчения транскрипции низок. 12 ацетилированных лизинов на гистоновый октамер усиливает транскрипцию хроматина in vitro на порядок. Помимо ослабления структуры хроматина, ацетилирование, возможно облегчает взаимодействие ацетилированных нуклеосом с другими факторами, участвующими в ремоделировании хроматина или с компонентами транскрипционного аппарата. Таким образом осуществляется комбинаторный эффект: с одной стороны ацетилирование-деацетилирование прямо влияет на структурную подвижность хроматина, а сдругой стороны оно влияет на белок-белковые взаимодействия разных факторов с белками хроматина. Ацетилирование остатков лизина в N-концевых "хвостиках" (tails) гистонов H2A , H2B , HЗ и H4 нейтрализует их положительный заряд и соответственно блокирует ассоциацию с витками нуклеосомной ДНК. Это, в свою очередь, декомпактизует структуру как самой нуклеосомы , так и хроматина в целом и, кроме того, освобождает внешнюю поверхность витков ДНК для взаимодействий с регуляторными факторами. Степень ацетилирования гистонов определяется активностью двух типов ферментов - гистонацетилтрансфераз HAT , (histone acetyl-transferases) и деацетилаз HDAC , (histone deacetylases). Ряд активаторов и коактиваторов транскрипции (в частности, такой важный, как CBP/300 , участвующий в регуляции клеточного роста, дифференцировки, репарации ДНК и апоптоза), а также некоторые субъединицы базального аппарата транскрипции ( ТАF11250 ) обладают гистонацетилтрансферазной активностью. Напротив, репрессоры транскрипции (такие, как Mad и ядерные рецепторы ) ассоциированы с деацетилазной активностью. В регуляцию транскрипции вовлекается также и ковалентная модификация ДНК. И эти две модификации белков и ДНК тесно переплетаются.



b) убиквитинирование, т.е. присоединение регуляторного белка убиквитина, в результате чего может измениться внутриклеточная локализация белка, белок может быть направлен на деградацию в протеасомах, и т.д.

c) гидроксилирование (например, в коллагене)

Лизин благодаря своей способности к образованию шиффовых оснований при взаимодействии с альдегидами может играть важную роль в ферментативном катализе. В качестве примера на схеме ниже показан механизм реакции, катализируемой фруктозодифосфатальдолазой - ферментом гликолиза и глюконеогенеза, катализирующем альдольную конденсацию дигидроксиацетофосфата и глицеральдегид-3-фосфата и обратную ей реакцию. [⁵]



Реакция, катализируемая альдолазой [3]



3. Информация о белок-белковых взаимодействиях

Некоторые аминоксилоты (такие, как аспарагиновая и глутаминовая) имеют "лишнюю" -COOH, другие (например, лизин) содержат дополнительную NH2-группу.При переносе протона с карбоксильной группы на амидную группу происходит образование цвиттер-иона, как и в простых аминокислотах. Солевой мостик может с легкостью образоваться между отрицательно и положительно заряженными группами, если цепи находятся на достаточно близком друг от друга расстоянии. Солевые мостики возникают между положительно и отрицательно заряженными боковыми радикалами аминокислотных остатков в белковой глобуле, это взаимодействие относится к электростатическим. Расстояние между атомами - не более 4 А. Аминокислотные остатки, которые могут образовывать солевые мостики: Asp и Glu (т.к. несут в боковом радикале отрицательно заряженные карбоксильные группы); Arg, Lys и His (т.к. несут в боковом радикале положительно заряженные группы). Образование солевых мостиков, как и любое другое электростатическое взаимодействие, подчиняется закону Кулона. Свободная энергия образования солевых мостиков зависит от среды, в которой они локализованы. Во внутренней неполярной области белка данная величина составляет порядка –5 ккал/моль, а в приповерхностных слоях белка – в 10-20 раз меньше.

Синдром Элерса - Данлоса

Синдром Элерса-Данлоса (несовершенный десмогенез, гиперэластическая кожа), наряду с несовершенным остеогенезом, синдромом Марфана и другими заболеваниями, относится к наследственным коллагенопатиям. Синдром Элерса-Данлоса неоднороден и включает в себя гетерогенную группу наследственных поражений соединительной ткани (соединительнотканных дисплазий), связанных с нарушением биосинтеза белка коллагена. Проявления синдрома Элерса-Данлоса носят системный характер и затрагивают опорно-двигательный аппарат, кожу, сердечно-сосудистую, зрительную, зубочелюстную и другие системы. Поэтому синдром Элерса-Данлоса представляет практический интерес не только для генетики, но и травматологии и ортопедии, дерматологии, кардиологии, офтальмологии, стоматологии. Сложность верификации и наличие легких форм затрудняет получение точных сведений об истинной распространенности синдрома Элерса-Данлоса; частота диагностированных среднетяжелых случаев составляет 1:5 000 новорожденным, тяжелых форм - 1:100 000.

Причины синдрома Элерса-Данлоса

Различные варианты синдрома Элерса-Данлоса различаются по типу наследования, первичным молекулярным и биохимическим дефектам. Однако в основе всех клинических форм лежат мутации генов, обусловливающие количественную или структурную патологию коллагена. На сегодняшний день молекулярные механизмы синдрома Элерса-Данлоса установлены не для всех форм заболевания. Так, известно, что I тип синдрома характеризуется снижением активности фибробластов, усилением синтеза протеогликанов, отсутствием ферментов, отвечающих за нормальный биосинтез коллагена. Синдром Элерса-Данлоса IV типа связан с недостаточностью продукции коллагена III типа; при VI типе заболевания имеет место недостаточность фермента лизилгидроксилазы, участвующего в гидроксилировании лизина в молекулах проколлагена. VII тип обусловлен нарушением превращения проколлагена I типа в коллаген; X тип - патологией плазменного фибронектина, участвующего в организации межклеточного матрикса и т. п. Патоморфологическая картина при различных типах синдрома Элерса-Данлоса характеризуется истончением дермы, нарушением ориентации и потерей компактности коллагеновых волокон, разрастанием эластических волокон, увеличением числа сосудов и расширением их просвета.

Классификация синдрома Элерса-Данлоса

Всего выделяют 10 типов синдрома Элерса-Данлоса, различающихся по генетическому дефекту, характеру наследования и клиническим проявлениям. Рассмотрим основные из них:

I тип синдрома Элерса-Данлоса (классический тяжелого течения) – наиболее частый вариант заболевания (43% случаев) с аутосомно-доминантным типом наследования. Ведущим симптомом является гиперэластичность кожи, растяжимость которой по сравнению с нормой увеличена в 2-2,5 раза. Характерна гипермобильность суставов, носящая генерализованный характер, деформации скелета, повышенная ранимость кожи, склонность к наружным кровотечениям, образованию рубцов, плохому заживлению ран. У части больных выявляется наличие моллюскоподобных псевдоопухолей и варикозного расширения вен нижних конечностей. Беременность у женщин с I типом синдрома Элерса-Данлоса часто осложняется преждевременными родами.

II тип синдрома Элерса-Данлоса (классический мягкого течения) – характеризуется вышеописанными признаками, но выраженными в меньшей степени. Растяжимость кожи превосходит нормальную лишь на 30%; гипермобильность отмечается преимущественно в суставах стоп и кистей; кровоточивость и наклонность к рубцеванию незначительны.

III тип синдрома Элерса-Данлоса – имеет аутосомно-доминантное наследование, доброкачественное течение. Клинические проявления включают генерализованную повышенную подвижность суставов, скелетно-мышечные деформации. Остальные проявления (гиперэластичность и рубцевание кожи, геморрагии) минимальны.

IV тип синдрома Элерса-Данлоса – встречается редко, протекает тяжело; может наследоваться различными путями (доминантно или рецессивно). Гиперэластичность кожи незначительна, отмечается повышенная подвижность только суставов пальцев рук. Ведущим проявлением данного типа заболевания является геморрагический синдром: склонность к образованию экхимозов, спонтанных гематом (в т. ч. во внутренних органах), разрывам полых органов и сосудов (в т. ч. аорты). Сопровождается высокой летальностью.

V тип синдрома Элерса-Данлоса – имеет Х-сцепленное рецессивное наследование. Характеризуется повышенной растяжимостью кожи, умеренно выраженными гипермобильностью суставов, кровоточивостью и ранимостью кожи.

VI тип синдрома Элерса-Данлоса - наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Кроме гиперэластичности кожи, наклонности к кровотечениям, повышенной подвижности суставов, имеются мышечная гипотония, тяжелый кифосколиоз, косолапость. Характерной чертой синдрома Элерса-Данлоса VI типа является глазной синдром, проявляющийся близорукостью, кератоконусом, косоглазием, глаукомой, отслойкой сетчатки и т. д.

VII тип синдрома Элерса-Данлоса (артроклазия) - наследуется как аутосомно-доминантно, так и аутосомно-рецессивно. Клиническую картину определяет низкий рост пациентов и гиперподвижность суставов, приводящая к частым привычным вывихам.

VIII тип синдрома Элерса-Данлоса – преимущественно наследуется аутосомно-доминантно. Ведущую роль в клинике играет хрупкость кожи, выраженный периодонтит, приводящий к ранней потере зубов.

X тип синдрома Элерса-Данлоса – характеризуется аутосомно-рецессивным наследованием; умеренной гиперэластичностью кожи и гипермобильностью суставов, стриями (полосовидной атрофией кожи), нарушением агрегации тромбоцитов.

XI тип синдрома Элерса-Данлоса – имеет аутосомно-доминантный тип наследования. У больных отмечаются рецидивирующие вывихи плечевых суставов, вывихи надколенника, встречается врожденный вывих бедра.

IX тип (Х-спепленный вариант вялой кожи) в настоящее время исключен из классификации синдрома Элерса-Данлоса. В современном варианте классификации синдрома Элерса-Данлоса рассматривается 7 основных типов заболевания:

классический (типы I и II)

гипермобильный (тип III)

сосудистый (тип IV)

кифосколиоз (тип VI)

артроклазия (тип VIIB)

дермоспараксис (тип VIIC)

недостаток тенасцина-X

Симптомы синдрома Элерса-Данлоса

Ввиду того, что подробная характеристика различных типов синдрома Элерса-Данлоса дана выше, в настоящем разделе обобщим основные проявления заболевания. Поскольку соединительная ткань присутствует практически во всех органах, проявления синдрома Элерса-Данлоса носят системный, генерализованный характер. Ведущим в клинической картине является кожный синдром: гиперэластичность кожи, которая легко собирается в складку и оттягивается. На ощупь кожа бархатистая, нежная, слабо фиксированная с подлежащими тканями, морщинистая на ладонных и подошвенных поверхностях. Гиперэластичность кожи при синдроме Элерса-Данлоса отмечается с рождения или дошкольного возраста, с годами имеет тенденцию к снижению. Кроме, гиперрастяжимости, характерна повышенная ранимость, хрупкость кожи, обнаруживающаяся в возрасте старше 2-3-х лет. Минимальная травматизация приводит к образованию длительно не заживающих ран, на месте которых спустя время формируются атрофичные или келоидные рубцы, псевдоопухоли.

Суставные проявления синдрома Элерса-Данлоса представлены гипермобильностью (разболтанностью) суставов, которая может носить локальный (например, переразгибание межфаланговых суставов) или генерализованный характер. Суставной синдром проявляется с началом ходьбы ребенка, что приводит к повторным подвывихам и вывихам. С возрастом гипермобильность суставов обычно уменьшается.

Со стороны сердечно-сосудистой системы у детей с синдромом Элерса-Данлоса нередко выявляются врожденные пороки сердца, пролапс митрального клапана, аневризмы сосудов головного мозга, варикоз. Отмечается склонность к кровотечениям - экхимозам, гематомам различной локализации, носовым, десневым, маточным, желудочно-кишечным кровотечениям.

Глазные проявления синдрома Элерса-Данлоса могут включать гиперэластичность кожи век, миопию, птоз, косоглазие, разрывы роговицы и глазного яблока при минимальных механических повреждениях, спонтанную отслойку сетчатки.

Изменения скелета при синдроме Элерса-Данлоса характеризуются воронкообразной или килевидной деформацией грудной клетки, сколиозом, кифозом, косолапостью, неправильным прикусом, частичной адентией. Висцеральные нарушения представлены птозом внутренних органов, пупочными, паховыми, диафрагмальными грыжами, рецидивирующим спонтанным пневмотораксом, дивертикулезом кишечника и др. Умственное развитие детей с синдромом Элерса-Данлоса обычно соответствует возрасту.

[1] - Майстер А. Биохимия аминокислот /Под ред. и с предисл.: А. Е. Браунштейн ; пер. с англ.: Г. Я. Виленкина – М. : Иностр. лит., 1961 . – 530 с

[2] - Queen Mary URL: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/reaction/AminoAcid/Lys3.html

[3] - StudyBlue URL: https://www.studyblue.com/notes/note/n/ch-14-glycolysis-gluconeogenesis--the-pentose-phosphate-pathway/deck/9763200

[4] - Центр "Красота и медицина" URL: http://www.krasotaimedicina.ru/diseases/children/ehlers-danlos

[5] - База знаний по биологии человека URL: http://humbio.ru/humbio/methilation/00006f1e.htm