Pubmed

PubMed - поисковая система, осуществляющая поиск по базе MEDLINE, в которой содержится более 20 млн. статей на медицинскую и биологическую тематику. Является основным инструментом поиска публикаций, относящихся к вышеназванным дисциплинам.
В данной работе производился поиск информации о роли CDK2 (Cyclin-dependent protein kinase 2 - циклинзависимой протеинкиназы 2) в регуляции клеточного цикла. В таблице 1 приведены результаты различных запросов в Pubmed

Таблица 1

Запрос	Запрос как его понял PubMed из Search details	Всего находок	Всего в открытом доступе	Всего обзоров
cdk2[ti] AND function[ti]	cdk2[ti] AND function[ti]	18	8	1
cdk2[ti] AND (cell cycle[ti] OR cancer[ti] OR apoptosis[ti])	cdk2[ti] AND (cell cycle[ti] OR cancer[ti] OR apoptosis[ti])	187	175	6
cell cycle[ti] AND Elledge SJ[au]	cell cycle[ti] AND Elledge SJ[au]	20	9	3
	related citations to An important role for CDK2 in G1 to S checkpoint activation and DNA damage response in human embryonic stem cells.	284	276	16
cyclin-dependent kinase 2[ti] AND checkpoint	cyclin-dependent kinase 2[ti] AND ("cell cycle checkpoints"[MeSH Terms] OR ("cell"[All Fields] AND "cycle"[All Fields] AND "checkpoints"[All Fields]) OR "cell cycle checkpoints"[All Fields] OR "checkpoint"[All Fields])	22	20	0
cdk2[ti] AND ("1991"[crdat] : "2006"[crdat]) AND review[pt]	cdk2[ti] AND ("1991"[crdat] : "2006"[crdat]) AND review[pt]	18	5	18

Одним из лучших запросов оказался последний
Была составлена коллеция (View my collection, "CDK2 cyclin-dependant protein kinase 2" from NCBI).
Можно отметить, что было найдено довольно много подходящих обзоров, не имеющихся, однако, в свободном доступе в полнотесктовой версии; некоторые старые статьи обозначены как имеющие открытую электронную версию, но при этом не приведено ни одной ссылки.
Ниже приведено краткое содержание одной из экспериментальных статей.

Cdk2 and Cdk4 Regulate the Centrosome Cycle and Are Critical Mediators of Centrosome Amplification in p53-Null Cells (→)

Авторы: Arsene M. Adon, Xiangbin Zeng, Mary K. Harrison, Stacy Sannem, Hiroaki Kiyokawa, Philipp Kaldis и Harold I. Saavedra

Введение

Увеличение числа центросом до трёх и более вызывает мультиполярные митозы, а следовательно, анеуплоидию и хромосомную нестабильность, что стимулирует биогенез раковых опухолей. Хорошо известно, что Cdk2 играет важную роль в регуляции центросомного цикла. Участие в ней Cdk4 исследовано хуже. В данной работе показано, что обе киназы необходимы для нормального протекания цикла центросом, а в случае отсутствия одной из них происходит преждевременное увеличение числа центросом.

К центросомам крепятся микротрубочки, осуществляющие растаскивание сестринских хроматид. Они состоят из двух центриолей, включающих, в свою очередь, белки α-тубулин, перицентрин, γ-тубулин, и центрин, а также белки клеточного цикла, такие как p53, Cdk2 и циклин Е. У нормальных клеток в G1 по одной центросоме, они удваиваются в процессе S-фазы, а в G2 представляют собой уже полностью разделённые белковые комплексы.
Циклин-зависимые киназы 4 и 2, связывающиеся соотвественно с циклинами D и E, отвечают за начало и продолжение перехода из фазы G1 в S.

Материалы и методы

Эмбриональные фибробласты мыши со сломанными p53, Cdk2 и Cdk4 в разных комбинациях. Клетки росли на среде FBS-DMEM.
Частота удвоения центросом была посчитана исходя из данных по окрашиванию комплексов антител с α- и γ-тубулином другими антителами, связанными с флуоресцирующим веществом. Для деструкции миктротрубочек в центросомах клетки были предварительно выдержаны во льду 30 минут, а перед этим часть клеток была обработана гидроксимочевиной.
Культуры клеток была разделены на три части, все они сначала выращивались при высокой плотности клеток, затем голодали на бедной среде, затем к ним снова была добавлена более питательная среда. Клетки из первой группы были немедленно фиксированы для исследования их центросом, во второй измерялось число перешедших в S-фазу с помощью бромдезоксиуридина, лизат частей третьей группы, росших после добавления питательной среды разное время, использовался для вестерн-блоттинга.
Иммунофлуоресценция.
Вестерн-блоттинг - перенесённые на поливинилдифлюоридную мембрану результаты фореза инкубируются сначала с антителами к требуемумому белку, а потом с антителами к нему, связанными с пероксидазой хрена. Детекция осуществляется по наличию продукта реакции.
Исследование микронуклеусов осуществялось с помощью окраски красителем DAPI.
Трансфекции: в клетки трёх различных групп линии с поломанным p53(гомозиготы) вводились плазмиды с NPM/B23 дикого типа или мутантным (Thr199 → Ala) помеченные FLAG-последовательностью, с помощью антител к которой удобно отслеживать вышеназванные белковые продукты. В качестве контроля производилась трансфекция пустого вектора. Также в плазмидах находился и ген устойчивости к неомицину. В клетки с поломанным Cdk4 также производилась трансфекция плазмиды с этим белком дикого типа или пустой.
РНК-интерференция: В клетки разных генотипов вводились малые интерферирующие РНК соответственно к Cdk2, Cdk4 и p53.
Исследование активности Cdk4: циклин-зависимая киназа 4 фосфорилирует пептид NPM, таким образом, активность фермента можно измерить по истощению коцентрации АТФ, что фиксируется с помощью измерения люминесценции.

Результаты

Эмбриональные фибробласты мыши пролиферируют несмотря на отсутствие Cdk2 и Cdk4, причём отсутcnвие одной из киназ не вызывает повышения уровня другой.
Клетки без Cdk2 и Cdk4 имеют ненормальные центросомные циклы (рис. 1). В результате нарушения связи деления центриолей с началом S-фазы, они начинают удваиваться раньше. При отсутствии Cdk4 или обеих киназ происходит нарушения цикла, причём и при мутации в геноме, и при уменьшении уровня экспрессии этих киназ с помощью РНК-интерференции
Отсутствие одной из протеинкиназ препятствует умножению числа центросом, предотвращая чрезмерную дупликацию центриолей
Генетически обусловленное неналичие Cdk2 или Cdk4 уменьшает хромосомную нестабильность у мутантов по p53
Отсутствие p53 ведёт к хромосомной нестабильности двумя путями, это умножение числа центросом и повышение концентраций активных форм кислорода, которые вызывают двухцепочечные разрывы ДНК. Для выяснения механизма влияния циклинзависимых киназ 2 и 4 на хромосомную нестабильность в мутантах по p53 был проведён анализ числа микронуклеусов, а также иммуностатирование γ-H2AX. Фосфорилирование последнего по серину со стороны С-конца является одним из первых ответов клетки на наличие двухцепочечного разрыва, таким образом число фосфорилированного γ-H2AX растёт линейно с ростом числа двойных разрывов. В клетках без p53 уровень такой вариации γ-H2AX много выше, чем в диком типе. Выключение Cdk2 или 4 вызвало уменьшение процента клеток, несущих фосфорилированный γ-H2AX, что согласуется с уже опубликованными наблюдениями о том, что потеря Cdk2 вызывает ухудшение репарации ДНК.
Микронуклеус - компактизованная хромосома или хромосомный фрагмент, обособленная от остального хроматина в результате потери центромерных последовательностей или же нарушений веретена делений. Эти структуры встречаются в повреждённых клетках в виде шарообразных агрегатов ДНК, окружённых ядерной мембраной. Частота встречаемости микронуклеусов в клетках характеризует потерю ими целых хромосом. Выключение одной из циклинзависимых киназ уменьшает образование микронуклеусов в мутантах по p53.
Cdk2 и Cdk4 вызывают увеличение числа центросом и хромосомную нестабильность путём фосфорилирования одного и того же сайта, треонина 199, у нуклеофосмина (NPM)
Нуклеофосмин - белок, связанный с центросомой, предотвращающий преждевременное разделение и дупликацию центриолей в течение фазы клеточного цикла G1. При его фосфорилировании белок диссоциирует от центриолей. Показано, что в клетках с мутантным по 199му остатку нуклеофосмином, несмотря на совпадающий с диким типом уровень экспрессии белка наблюдалась в разы меньшая частота увеличения числа центросом.

Рис.1 Модель, объясняющая, как удаление Cd-киназ предотвращает умножение центросом (A) Нокаут p53 вызывает снижение уровня p21Waf1, вызывая гиперактивность Cdk2 и Cdk4. Гиперактивные Cd-киназы взаимодействуют двумя способами с центросомой. Во-первых, они гиперфосфорилируют Rb в ядре, что вызывает неконтролируемую E2F-зависимую транскрипцию молекул, которые влияют на различные стадии цикла дупликации центросом: например, вовлечённые в разделение центриолей, такие, как киназы дупликации центриолей (CtDKs). Во-вторых, они существенно фосфорилируют NPM (по T199),что приводит к снятию запрета на излишнюю дупликацию центросом. Неконтролируемая экспрессия CtDKs и неспособность NPM супрессировать дупликацию центриолей приводит к ускорению скорости прохождения центросомного цикла и тому, что он происходит несколько раз за один клеточный цикл, фаза с одной центросомой исчезает. Результатом этого становится формирование большого числа центросом.
(B)Когда Cdk2 или Cdk4 удалены из p53-/- эмбриональных фибробластов мыши, Rb недофосфорилируется, CtDKs транскрибируются в нормальном количестве. Недофосфорилированный NPM ограничивает разделение центриолей. Это ограничивает число центросомных циклов в один на клеточный цикл, результатом чего становится нормальное число центросом в клетке.