Секвенирование по Сэнгеру

Восстановление последовательности ДНК по данным из капиллярного секвенаторa. Чтение хроматограмм.

Table 1. Files
Исходный файл с ридом прямой последовательности 19_F.ab1 19_R.fasta
Исходный файл с ридом обратной последовательности 19_R.ab1 19_F.fasta

Характеристика хроматограмм

Оценка длины нечитаемых участков в начале и конце.

Picture 1. В начале прямой цепочки проблемы с прочтением 1-22 нуклеотидов
Picture 2. В конце прямой цепочки проблемы с прочтением 771-779 нуклеотидов
Picture 3. В начале обратной цепочки проблемы с прочтением 1-14 нуклеотидов, в конце цепочки проблем нет

Oценкa отношения сигнала и шума в среднем

Приблизительное отношение сигнала к шуму - 20:1. Сигнал в хроматограммах достаточно неравномерный: пики сильно различаются.

Анализ и редактирование хроматограмм с помощью программы Geneious.

С помощью программы Geneious я получила выравнивание для прямой и обратной последовательностей, собрала контиг.

Picture 4. Контиг отмечен голубым цветом
Picture 5. На данном графике наглядно показаны совпадения и различия в прямой и обратной последовательностях
 Контиг был получен с учетом следующих рекомендованных параметров выравнивания: threshold Highest Quality (60%) - bases matching at least 60% of total adjusted chromatogram quality
Table 2. Files
Выравнивание прямой и обратной последовательностей в формате .fasta 2
Выравнивание прямой, обратной последовательностей и контига в формате .fasta 3
Picture 6. Заменила в прямой цепи N на С, нуклеотид в контигне программа выбрала верно.
Picture 7. Заменила в прямой цепи N на G, нуклеотид в контигне программа выбрала верно.
Picture 8. Заменила в прямой цепи N на А, нуклеотид в контигне программа выбрала верно.
Picture 9. Заменила в прямой цепи N на А, нуклеотид в контигне программа выбрала верно.

Результат — консенсусная последовательность в формате fastа.

Пример нечитаемого фрагмента хроматограммы

Picture 10. Сильное загрязнение сигналом от G нуклеотида, вызванное сбоями в работе прибора/загрязнением другой ДНК.