ЯМР vs РСА
Молекула для этого практикума - убиквиктино-подобный белок SUMO1.
Задание 1. Сравнение моделей.
1Y8R - кристаллографическая расшифровка SUMO1 в комплексе с Е1-лигазой. Разрешение: 2,75 Å.
6JXV - расшифровка комплекса SUMO1 с мотивом SLS4 вирусного белка ICP0, полученная с помощью ЯМР. Число моделей: 20.
Рассмотрим различия расшифровок.
В РСА-модели присутствуют две копии комлекса, образующие ассиметричную единицу кристалла. У ЯМР-моделей, конечно же, такого нет, потому что нет и кристалла. Молекулы воды также принадлежат модели РСА - при проведении ЯМР-эксперимента используют дейтерированную воду, чтобы детектировать только протоны белка.
Стабильные вторичные структуры - α-спирали и β-листы - в ЯМР- и РСА-моделях хорошо сопоставимы, а вот неструктурированные участки свёрнуты немного по-разному. Особенно отличается С-конец - в ЯМР-моделях он свёрнут и находится ближе к белковой глобуле (такое расположение, наверняка, оптимальнее в растворе), а в РСА-модели он выпрямлен, так как связывается с остатками одной из субъединиц Е1-лигазы. Несколько остатков N-конца в ЯМР-моделях отсутствуют (скорее всего, из-за подвижности - авторы статьи пишут о такой же проблеме для концевых остатков SLS4 на 1H-1H NOESY спектре: "...resonances are broadened because of conformational exchange").
На рисунке 2 стрелками показаны участки белка, для которых у ЯМР- и РСА-моделей по-разному определена вторичная структура - в первом случае отображается как неструктурированная область, во втором - как спираль (возможно, это результат того, что атомы соответствующих остатков в растворе и в кристалле занимают немного разные положения и, следовательно, втором случае остовные углы поворотов соответствуют паттерну спирали, а в первом нет).
Из различий на уровне остатков можно отметить то, что в ЯМР-моделях есть водороды, потому что в эксперименте снимают протонные спектры. В РСА-модели водородов нет - разрешение слишком низкое.
Задание 2. RMSF.
Мерой подвижности участков белка во времени для ЯМР-ансамблей является RMSF (Root Mean Square Fluctuation). Если ансамбль ЯМР-моделей отражает подвижность белка во времени, то мы увидим положительную зависимость (типа y = √x, исходя из размерностей величин) между значениями RMSF остатков ЯМР-ансамбля и значениями В-фактора остатков РСА-модели (при условии, что основной вклад в экспериментальные значения В-фактора вносит конформационная вариабельность). Проверим, можно ли принять данный ЯМР-ансамбль за отражение подвижности белка.
Сначала я построила график зависимости RMSF от В-фактора для всех одинаковых остатков, представленных в моделях (Tyr(21)-Gly(97), цепь А в ЯМР-расшифровке и цепь С в РСА-расшифровке). Положительный тренд если и прослеживается, то с большим трудом. Посчитаем коэффициент корреляции Спирмана: 0,2 при p-value 0,078 - недостаточно оснований отвергнуть нулевую гипотезу о том, что ρ = 0, значит, корреляции между величинами нет.
Попробуем исключить из рассмотрения 5 остатков на С-конце белка, которые не выравниваются align в PyMol'е (я писала выше, что в РСА-модели С-конец взаимодействует с субъединицей Е1-лигазы, поэтому у него наверняка снижен В-фактор).
Даже картинка стала получше - несколько точек с высоким RMSF и низким В-фактором исчезли, и положительный тренд просматривается легче. Коэффициент корреляции Спирмана: 0,31 при p-value 0,0078 - вот это уже может говорить о положительной монотонной зависимости, хотя и слабой. Я бы сказала, что данный ансамбль ЯМР-моделей не нужно с уверенностью принимать за отражение подвижности белка.
Точное сравнение показало, что равенства между величинами (RMSF)2 и 3(В-factor)/8π2 и близко нет... Взяла для рассмотрения 594 атома (те же остатки, что в предыдущем случае, без водородов), RMSF перевела в Å, чтобы размерность была одинаковой с В-фактором (если я всё правильно поняла). Если обрезать ось Y до меньших значений, картина лучше не становится. Проведённое сравнение подтверждает, что данный ансамбль ЯМР-моделей не отражает подвижность белка.
Задание 3. Н-связи.
В стабильной вторичной структуре внутри глобулы водородные связи между остовными атомами формируются как в кристалле, так и в растворе.
Внешние боковые радикалы остатков в стабильных вторичных структурах подвижнее остова, поэтому в растворе связи между ними не всегда сохраняются.
В неструктурированных подвижных участках снаружи белковой глобулы остатки могут вовсе не образовывать Н-связи в растворе (в кристалле соответствующий участок обозначен как спираль - возможно, за счёт гидрофобных взаимодействий с остатками одной из субъединиц Е1-лигазы (Рис. 8) атомы остатков в этом участке занимают такие положения, что остовные торсионные углы соответствуют паттернам α-спирали, как и рассматриваемая Н-связь, поэтому PyMol может размечать этот участок наблюдаемым образом).
