Карманы связывания лигандов. Докинг

Задание 1. Свободная vs связанная формы белка.

 Чтобы визуализировать сайт связывания лиганда в белке, я выделила остатки в моделях свободной и связанной форм в радиусе 5 Å от лиганда.

Картиночка из паймола
Рис. 1. Общий вид кармана связывания лиганда. Белый - свободная форма белка; бирюзовый - связанная форма белка; маджентовый - лиганд.

 На рисунке 1 можно увидеть, что петли слева и сверху сдвинуты в связанной форме белка по сравнению со свободной. Сдвиг левой петли обеспечивает "закрытие" кармана - тирозин отграничивает лиганд от растворителя.
 Хотя ароматические боковые радикалы смещены в связанной форме, для стекинга с лигандом геометрия мне кажется не лучшей. Но тем не менее, судя по количеству и расположению гидрофобных остатков в карамане, лиганд хорошо стабилизируется гидрофобными взаимодействиями.

Картиночка из паймолаКартиночка из паймола


Рис. 2. Слева: солевой мостик между Glu-286 и Lys-271 в обеих формах белка. Справа: Н-связь Tyr-253 с Asn-322, поддерживающая "закрытое" состояние кармана в связанной форме.

 Ионное взаимодействие между Glu-286 и Lys-271 стало немного сильнее - в связанной форме (бирюзовая) остатки слегка сблизились. Также в связанной форме тирозин, "закрывающий" карман, образует водородную связь с Asn-322, стабилизирующую такое положение петли с тирозином.

 Рассмотрим информацию о карманах белка, полученную с помощью POCASA.

Картиночка из паймолаКартиночка из паймола


Рис. 3. Слева: топ-5 самых объёмных карманов свободной формы белка по версии POCASA. Справа - то же для связанной формы (лиганд удалён). Аналогичные карманы покрашены одинаковыми цветами.
Тэйбл
Табл. 1. Топ-5 самых объёмных карманов в свободной и связанной формах белка по версии POCASA. Зеленый - карман связывания лиганда.

  На мой взгляд, действительно, самые объёмные карманы данного белка программа и выдала. Объём кармана связывания лиганда при подсчёте POCASA увеличен для связанной формы по сравнению со свободной, но это можно объяснить тем, что в свободной форме карман более открытый и широкий, поэтому сервис только его "дно" считает за углубление в глобуле, а более выдающиеся части, видимо, неровностями...
 Перестройка кармана, как мне кажется, происходит постепенно в процессе связывания лиганда, увеличивая афинность. Аспартат-381, например, мешал бы стабилизации крайнего хлорированного кольца лиганда, если бы не сдвигался с места до окончания процесса связывания (Рис. 1). Так что я предполагаю, что индуцированное соответствие в данном случае есть. Попробуем проверить.

Задание 2. Протонирование.

 Протонирование свободной формы белка осуществлялось с помощью сервиса PDB2PQR, который использует программу PROPKA для предсказания pKa. В числе остатков с наиболее отличающимся от референса значением рКа присутствует Asp-421, входящий в состав α-спирали, расположенной в стороне от сайта связывания лиганда. При референсном значении 3,8 предсказанная рКа данного остатка составляет 7,02. Учитывая, что по умолчанию PDB2PQR работает с рН = 7, можно ожидать водород у карбоксильной группы бокового радикала.

Картиночка из паймола
Рис. 4. Asp-421 и его Н-связи с окружением. Модель свободной формы белка протонирована PDB2PQR.

 Действительно, водород у кислорода карбоксильной групы есть, но смысла в нём нет - в обеих водородных связях атомы остатка могут выступать акцепторами. Мне кажется, в данном случае сервис ошибся с предсказанием, и водорода у этого карбоксила быть не должно.

 Я также проверила выдачу PROPKA для связанной формы белка. Asp-421 снова попал в группу остатков с наиболее отличающимися от референсных значениями рКа, причём предсказанное значение увеличилось по сравнению со свободной формой белка - оно составляет 8,14. Водород на карбоксиле точно будет. Посмотрим, оправданно ли его существование в модели.

Картиночка из паймола
Рис. 5. Asp-421 и его Н-связи с остовом His-361. Модель связанной формы белка протонирована PDB2PQR.

 Видно, что в модели связанной формы белка остатки смещены по сравнению со свободной, и напротив Asp-421 находится только остов гистидина. Н-связь с азотом остова гистидина слабовата - расстояние 3 Å, а вот для связи с кислородом остова гистидина расстояние и геометрия хорошие, если водород на кислороде карбоксила бокового радикала Asp-421 есть. Так что в данном случае такое предсказание рКа выглядит даже довольно обоснованным.

 С помощью SPORES было выполнено протонирование лиганда.

Картиночка из паймолаКартиночка из паймола

Рис. 6. Слева: лиганд до протонирования. Справа: лиганд после протонирования SPORES.

 У данного лиганда с протонами всё, вроде, довольно однозначно. По-моему, SPORES справился хорошо.

Задание 3. Докинг.

 В выдаче Webina 1ая и 3я позы лиганда очень похожи между собой и похожи на позу лиганда из модели связанной формы белка. Сравним с помощью PoseView взаимодействия лиганда с белком в модели связанной формы и взаимодействия лучшего варианта докинга в свободную форму.

Картиночка из паймолаКартиночка из паймола

Рис. 7. Слева: взаимодействия лиганда с остатками кармана связанной формы белка. Справа: взаимодействия 1ого варианта лиганда из выдачи Webina с остатками кармана свободной формы белка.
Картиночка из паймола
Рис. 8. Положение лиганда в кармане связывания. Белый - свободная форма белка; бирюзовый - связанная форма белка; маджентовый - лиганд из модели связанной формы; изумрудный - 1ый вариант расположения лиганда из выдачи Webina; пунктирные линии - Н-связи, образуемые соответствующими по цвету лигандами.

 Я согласна с PoseView по поводу найденных взаимодействий.
 Видно, что отличий во взаимодействиях почти нет. Дополнительных связей с лигандом к концу стабилизации не образуется, якорные взаимодействия, в основном, сохраняются. В варианте, полученном с помощью докинга, есть гидрофобное взаимодействие с фенилаланином, которого нет в модели связанной формы белка - это, судя по рисункам 7 и 8, связано с положением концевой метильной группы лиганда. Водородная связь лиганда с остовным кислородом метионина-318 становится сильнее после окончания стабилизации лиганда в кармане - расстояние между донором и акцептором сокращается; водородная связь с азотом остова метионина-318 немного ослабевает (вероятно, незначительно).
 Насчёт индуцированного соответствия я ошибалась - судя по результатам докинга, его нет. Карман закрывается тирозином уже после стабилизации лиганда, а Asp-381 изначальному связыванию не препятствует.