Введение

Метод “терминаторов” - ~ 1000 п.н. - “Золотой” стандарт

• “+” - одновременно идет сиквенс большого количества разных фрагментов

• “-” - прочтения длиной 75 - 150 нукл

• Расшифровка структуры ДНК (1953)

  • Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон, Морис Уилкинс, Нобелевская премия 1962

• Секвенирование по Сэнгеру (1975 – 1977)

  • Фредерик Сэнгер, Нобелевская премия 1980 (вторая!) (с Уолтером Гильбертом и Полем Бергом)

• Полимеразная цепная реакция (1985 – 1986)

  • Кэрри Муллис, Нобелевская премия 1993 (совместно с Майклом Смитом)

• NGS — совокупность методов (454, Illumina, Oxford Nanopore, PacBio и проч.) (2005 – наст. вр.)

Как именно можно секвенировать ДНК:

• полный геном

• экзом (кодирующая часть генома)

• таргетное ресеквенирование

• секвенирование определенных локусов ДНК, полученных в результате специфической пробоподготовки (ChIP-seq, Hi-C, ATAC-seq, …)

“Плюсы”

• Небольшой объем кодирующих данных - ниже цена

• Кодирующие последовательности лучше изучены

• Большое число болезнетворных мутаций находится в кодирующей последовательности

“Минусы”

• Нет информации о некодирующих участках

• Неравномерность покрытия экзонов

Исследование спейсерных последовательностей рРНК

Зачем?

• 1000 genomes, gnomAD: частоты вариантов в популяциях

• GWAS: поиск полиморфизмов, ассоциированных с болезнями:

  • моногенные (муковисцидоз, ген CFTR)

  • полигенные (ишемическая болезнь сердца, шизофрения, …)

• Фармакогенетика и индивидуальные особенности

  • варфарин

  • исследование генов из системы свертывания крови

Р - вероятность ошибки

Q - параметр качества (Phred Quality Score)

Значения Q: 1-40

Q > 20 считается хорошим качеством

• Basic Statistics

• Per base sequence quality

• Per tile sequence quality

• Per sequence quality scores

• Per base sequence content

• Per sequence GC content

• Per base N content

• Sequence Length Distribution

• Sequence Duplication Levels

• Overrepresented sequences

• Adapter Content

Полный пузырный занос

• оплодотворение дефектной яйцеклетки без хромосом

• отцовские хромосомы удваиваются

• эмбрион не образуется

• 46, XX karyotype

• European origin

• 30× PacBio circular consensus sequencing (HiFi)

• 120× Oxford Nanopore ultralong-read sequencing (ONT)

• 100× Illumina PCRFree sequencing (ILMN)

• 70× Illumina Arima Genomics Hi-C (Hi-C)

• BioNano opticalmaps

• Single-cell DNA template strand sequencing (Strand-seq)

• RNA-seq

Данные экзомного секвенирования конкретного человека:

• чтения fastq

• референсный геном hg38

• экзомный таргет

Найти отличия образца от референса

• SNV: однонуклеотидные варианты, т.е. изменение одного нуклеотида

• Короткие вставки и делеции (~ 50 п.н.)

• Структурные варианты: инверсии и транслокации; CNV

• Анеуплоидии: нульсомии, моносомии, трисомии, полисомии

• Полиплоидизация

• fasta

• fastq

• bam

• sam

• cram

• vcf

• gvcf

• bed

• gtf

• gff

• Четко представлять общую задачу

• Знать биологический объект (организм, клеточная линия, ткань)

• Представлять особенности пробоподготовки и дизайн эксперимента

• Оценить объем и качество входных данных

• Узнать на каком приборе было проведено секвенирование

• Выбрать версию референсного генома, если он используется, и оценить его качество

• При использовании дополнительных данных (например, разметка генов) зафиксировать версию файла и соотнести с версией выбранного генома

• Четко фиксировать все шаги программного конвейера, включая версии программ и пакетов, сохранять и комментировать код

• Проверять объем данных на каждом этапе

• Проверять качество каждого шага протокола обработки

• Вести лабораторный журнал (!)

• Бэкапы!

• Результаты лучше всего хранить в статьях =)