Секвенирование РНК

Типы РНК

Сколько типов РНК вы знаете?

Назовите хотя бы 10 разных классов РНК

Типы РНК

  • матричные/информационные РНК - мРНК - mRNA

  • транспортные РНК - тРНК - tRNA

  • рибосомальные РНК - рРНК - rRNA

  • микроРНК - microRNA

  • малые интерферирующие РНК - миРНК - siRNA

  • малые ядерные РНК - мяРНК - snRNA

  • малые ядрышковые РНК - мякРНК - snoRNA

  • PIWI-связывающие РНК - пиРНК - piRNA

  • длинные некодирущие РНК - днкРНК - lncRNA

  • энхансерные РНК - эРНК - eRNA

  • кольцевые РНК - circRNA

  • промоторные РНК - PROMPTs

  • …

У всех свой особенный процессинг!

Классификация

Один из вариантов!

Emerging role of non‐coding RNA in health and disease

Классификация

Другой вариант

Long Non-Coding RNA (lncRNA) Roles in Cell Biology, Neurodevelopment and Neurological Disorders

  • snoRNA: small nucleolar RNAs;

  • tiRNA: transcription initiation RNA;

  • snRNA: small nuclear RNA;

  • scRNA: small cytoplasmic RN;

  • PROMPTs: promoter upstream transcripts;

  • rRNAs: ribosomal RNAs;

  • tRNAs: transfer RNAs;

  • miRNA: micro RNA;

  • piRNA: piwi RNA;

  • siRNA: small interfering RNA;

  • crasiRNA: centromere repeat-associated small interacting RNA;

  • telsRNA: telomere-specific small RNA;

  • lincRNA: long intergenic noncoding RNA;

  • eRNA: enhancer-derived RNA;

  • TUCRNA: transcribed ultraconserved RNA;

  • NAT: natural antisense transcript;

  • cis-lncRNA: cis-acting long non-coding RNA;

  • ceRNA: competing endogenous RNA;

  • trans-lncRNA: trans-acting long non-coding RNA

Геном человека

Catalyzing Transcriptomics Research in Cardiovascular Disease: The CardioRNA COST Action CA17129

Внутри клетки млекопитающего

Non-coding RNA: what is functional and what is junk?

Основные этапы исследования

  • Пробоподготовка

  • Секвенирование

  • Биоинформатический анализ

?

Откуда, как и какую РНК мы будем брать?

Фракции РНК

  • тотальная РНК

  • деплеция рРНК

  • полиА

  • длинные и малые РНК

  • ядерные и цитоплазматические

  • новотранскрибированные

  • ассоциированные с хроматином

  • …

Вот тут хорошо бы понимать процессинг каждого типа РНК

Типы и фракции - это разные вещи!

Хотим

Секвенировать РНК

Секвенатор (Illumina) принимает на вход ДНК-библиотеку

Как быть?

Пробоподготовка

RNA Sequencing and Analysis

Экспериментальные этапы

  • Подготовка нужной фракции РНК

  • Проверка качества РНК

  • Обратная транскрипция => кДНК

  • Фрагментация (~200-300 нукл)

  • Секвенирование (чем глубже покрытие и больше реплик, тем лучше)

Подходы к секвенированию

  • Секвенирование популяции клеток - bulk rna-seq

    • говорим про этот вариант

    • на примере Illumina

    • в чем плюсы и минусы подхода?

  • Секвенирование единичных клеток

  • Длинноридовое секвенирование

Реплики

  • Что это такое?

  • Какие бывают?

  • Зачем нужны?

Реплики

  • Технические реплики - повторный анализ одного и того же образца (одна пробоподготовка)

  • Биологические реплики - такое же исследование аналогичного образца (разные/параллельные пробоподготовки)

Statistical relevance—relevant statistics, part I

Реплики

RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication?

Цепь-неспецифическая библиотека

Stranded vs Non-Stranded RNA-Seq

Цепь-специфическая библиотека

Stranded vs Non-Stranded RNA-Seq

Основные этапы биоинформатического анализа

  • На вход: чтения в формате fastq

  • Проверка качества чтений

  • Картирование чтений на референсный геном

  • Квантификация РНК

Биоинформатика

RNA Sequencing and Analysis

Картирование

Read mapping or alignment

Modeling and analysis of RNA-seq data: a review from a statistical perspective

У генов бывают разные транскрипты

GENCODE

GENCODE

GENCODE

GENCODE - releases

GTF

HTSeq-count

HTSeq-count

Матрица каунтов

Технические задачи

  • Построение экспрессионного профиля

  • Анализ дифференциальной экспрессии

  • Поиск новых генов и транскриптов

  • Исследование структуры транскриптов

  • Анализ дифференциального сплайсинга

  • Модификации РНК

  • Построение генных сетей

  • …

Задача

Построить транскрипционный профиль микроРНК по образу bulk rna-seq, фракция РНК - тотальная с деплецией рРНК

Конец!