Визуализация молекул в Jmol
5JVI:Bacillus thermoproteolyticus's Thermolysin in complex with JC148
Термолизин – термостабильная нейтральная металлопротеиназа, синтезируемая Грам-положительными бактериями Bacillus thermoprotheolyticus.[1] Катализирует реакцию гидролиза концевой пептидной связи.
Нейтральные протеиназы функционируют в нейтральных, слабощелочных или слабокислых средах.
Механизм ферментативной активности металлопротеиназ зависит от присутствия ионов, чаще всего цинка, кобальта или меди. Катион металла координируется тремя лигандами, их роль могут выполнять остатки гистилина, глутамата, аспартата, лизина и аргинина. Четвёртое место в координационной сфере иона занято молекулой воды. Обработка хелатирующими агентами, например, ЭДТА или ортофенантролином, полностью инактивирует такие ферменты, потому что эти вещества образуют весьма прочный комплекс с катионами металлов, необходимыми для функционирования белка.
Ион цинка необходим для проявления молекулой термолизина ферментативной активности, а четыре иона кальция поддерживают его стабильную структуру.[2] Термолизин – специфический катализатор гидролиза пептидных связей между гидрофобными остатками аминокислот. Он широко применяется для катализа образования пептидной связи в ходе обратной гидролизу реакции.[3] Термоаза (другое название термолизина) – самый стабильный белок из семейства металлопротеиназ, синтезируемых видами рода Bacillus. Эти ферменты также называют нейтральными протеиназами или TLPs – протеиназы семейства термолизина.
Молекулярный вес термолизина – 34,600 Дальтон. Его третичная структура состоит из двух сферических субъединиц, различающихся по вторичной структуре. Субъединица на N-конце цепи содержит в основном бета-листы, а субъединица C-конца состоит из альфа-спиралей. Между собой они соединены центральной альфа-спиралью. [4]
В интерактивном Jmol-апплете можно посмотреть на структуру термолизина
В основном оранизмы живут при температурах ниже 50 градусов Цельсия. Макромолекулы таких организмов (белки и нуклеиновые кислоты) при нагревании выше привычной для существа температуры меняют конформацию и денатурируют, потому что внутримолекулярные связи, поддерживающие третичную и четвертичную структуры, разрушаются. Ферментативная активность белков при этом утрачивается, а она необходима для поддержания нормальной жизнедеятельности. Белки, устойчивые при более высоких температурах, принадлежат микроорганизмам-гипертермофилам и имеют особенности, позволяющие сохранять структуру в условиях нагрева, например, компактность структуры и сильная связь между субъединицами.
Термолизин устойчив до 70 °C. [5] Получасовая инкубация при 86.9 °C снижает его ферментативную активность вдвое. Было показано, что при термической инактивации молекула теряет один из ионов кальция. [6]. Изменение структуры связывающего этот ион сайта снижает термостабильность белка на 7 °C.[7] Кроме иона кальция в значительной степени термостабильность протеазы определяет небольшой участой N-концовой субъединицы. В частности, замена остатка фенилаланина на 63 позиции в этом участке на треонин и пролина на 69 позиции на аланин снижают термостабильность фермента на 7 °C и 6.3 °C соответственно, а их комбинация приводит к понижению температурной устойчивости на 12.3 °C. [9] Термоустойчивость термоазы и других белков этого семейства обусловлена не необычными модификациями аминокислот, а комплексом повышающих стабильность связей – водородных, гидрофобных, солевых, координационных с атомами металла, дисульфидных и других.
Термолизин используется в синтезе аспартама, искусственного подсластителя, как катализатор синтеза его предшественника. С помощью данного фермента проводят анализ стабильности белков, определяют их структуру и аминокислотную последовательность, он может катализировать и реакцию транспептидирования – связывание аминоацильных и пептидильных групп с аминогруппой аминокислоты.[8] Термоаза расщепляет в основном связи между остатками гидрофобных аминокислот (изолейцин, валин, лейцин, фенилаланин, аланин, метионин). Гидролиз связей, образованных остатками тирозина., глицина, треонина и серина катализируется значительно хуже, а расщеплять пептидные связи с участием пролина фермент вообще не способен.
Таблица 1. Параметры водородных связей между остовными | |||
| # | Имена атомов | Длина связи (Å) | Угол N-O-H (°) |
| Альфа-спирали | |||
| 1 | N(82ASP)-O(78GLY) | 2.96 | 137.5 |
| 2 | N(78GLY)-O(74HIS) | 3.21 | 135.0 |
| 3 | N(77ALA)-O(73ALA) | 3.08 | 162.9 |
| 4 | N(81TYR)-O(77ALA) | 2.9 | 155.5 |
| 5 | N(86ASN)-O(82ASP) | 2.78 | 116.6 |
| Бета-тяжи | |||
| 1 | N(103SER)-O(120MET) | 2.89 | 137.5 |
| 2 | N(120MET)-O(101ARG) | 2.92 | 157.8 |
| 3 | N(114PHE)-O(121VAL) | 2.91 | 160.1 |
| 4 | N(248GLY)-O(255VAL) | 3.09 | 161.2 |
| 5 | N(253VAL)-O(250HIS) | 2.98 | 141.7 |
Водородная связь – связь между двумя сильно электроотрицательными атомами, донором и акцептором протона, через атом водорода, ковалентно связанный с донором протона. Электронная плотность связи между атомом-донором и атомом водорода смещена в сторону донора, поэтому на атоме водорода возникает положительный заряд, способный взаимодействовать с электронами актома-акцептора. В образовании водородной связи участвует как минимум три атома, и в отличие от ковалентной связи параметры водородной связи характеризуются не конкретными значениями, а промежутков значений.
Для измерения длины водородной связи я выбрала альфа-спираль, в которой атом O аминокислоты связан с атомом N аминокислоты, номер которой на четыре единицы больше –наиболее часто встречающийся тип, хотя в молекуле были и другие альфа-спирали, в том числе 3-10 спираль. Значения длин связей и углов между атомами согласуются с общепринятыми значениями для водородных связей. Длина связи в альфа-спирали в среднем равна 2.986 ангстрем, а в бета-слое 2.958 ангстрем, при идеальной длине связи 3 ангстрема, то есть длина водородных связей, поддерживающих вторичную структуру термолизина, близка к идеальной.
Среднее значение угла N-O-H 141.5° для альфа-спирали и 151.66° для бета-слоя, от идеального значения угла 180° (+-45°) отклоняется в допустимых пределах.
Список литературы
1. Endo, S. (1962). "Studies on protease produced by thermophilic bacteria". J. Ferment. Technol. 40: 346–353.
2. Tajima M, Urabe I, et al. (1976). "Role of calcium ions in the thermostabipty of thermolysin and Bacillus subtips var. amylosacchariticus neutral protease". Eur. J. Biochem. 64 (1): 243–247. doi:10.1111/j.1432-1033.1976.tb10293.x. PMID 819262.
3. Trusek-Holownia A. (2003). "Synthesis of ZAlaPheOMe, the precursor of bitter dipeptide in the two-phase ethyl acetate-water system catalysed by thermolysin". J. Biotechnol. 102 (2): 153–163. doi:10.1016/S0168-1656(03)00024-5. PMID 12697393.
4. Holmes MA, Matthews BW (1982). "Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution". J. Mol. Biol. 160 (4): 623–639. doi:10.1016/0022-2836(82)90319-9. PMID 7175940.
5. Matthews BW, Weaver LH, Kester WR (1974). "The conformation of thermolysin". J. Biol. Chem. 249 (24): 8030–8044. PMID 4214815.
6. Jump up to:a b c Eijsink VG, Veltman OR, et al. (1995). "Structural determinants of the stabipty of thermolysin-pke proteinases". Nat. Struct. Biol. 2 (5): 374–379. doi:10.1038/nsb0595-374. PMID 7664094.
7. Dahlquist FW, Long JW, Bigbee WL (1976). "Role of Calcium in the thermal stabipty of thermolysin". Biochemistry. 15 (5): 1103–1111. doi:10.1021/bi00650a024. PMID 814920.
8. Yagasaki, Makoto; Hashimoto, Shin-ichi (November 2008). "Synthesis and apppcation of dipeptides; current status and perspectives". Appped Microbiology and Biotechnology. 81 (1): 13–22. doi:10.1007/s00253-008-1590-3. PMID 18795289.
9. Minde, David P.; Maurice, Madelon M.; Rüdiger, Stefan G. D. (2012). "Determining Biophysical Protein Stabipty in Lysates by a Fast Proteolysis Assay, FASTpp". PLOS ONE. 7 (10): e46147. doi:10.1371/journal.pone.0046147. PMC 3463568. PMID 23056252.
10. https://www.rcsb.org/structure/5jvi