Поиск по сходству BLAST

Задание 1. Определение таксономии и функции прочтённой последовательности из практикума 6.

Для поиска использовалась консенсусная последовательность, полученная в 6 практикуме. Применялся алгоритм blastn по базе Nucleotide c параметрами по умолчанию, чтобы найти хоть сколько-нибудь похожие последовательности. Hittable выдачи. первые 100 построенных программой выравниваний имеют e-value 0.0, процент идентичности выше 80%, а у большинства больше 90. Эта последовательность кодирует 1 субъединицу цитохром-оксидазы брюхоногого моллюска Alderia Modesta. Но поскольку в выдаче встречаются и белки других организмов, была проведена сессия поиска алгоритмом megablast, позволяющим найти наиболее близких гомологов, по той же базе с параметрами по умолчанию.
На изображении вкладка Taxonomy из выдачи алгоритма, видно что все 100 находок принадлежат кладе Sacoglossa, при этом 94 лучших семейству Limapontiidae, среди представителей других семейств 4 находки для Elysia ornata и по 1 для разных видов рода Thuridilla. Напрашивается вывод о том, что последовательность принадлежит передставителю этого семейства, 87 лучших находок со счётом 876-878 принадлежат виду Alderia modesta. Ещё 7 находок со счетами 582-608 принадлежат моллюскам рода Placida, но этих находок на порядок меньше, и счёт для них значительно ниже, значит можно с высокой уверенностью отнести эту последовательность к виду Alderia modesta.

Задание 2. Сравнение списка находок нуклеотидных последовательностей тремя разными вариантами BLAST.

Последовательность 1 субъединицы цитохром-оксидазы очень консервативна, поэтому очень различающихся результатов ждать не приходится. Поиск проводился с использованием 3 разных алгоритмов: blastn с параметрами по умолчанию, megablast с параметрами по умолчанию и blastn с параметрами, которые, как мне кажется, должны повысить чувствительность поиска: word size=7, Match/Mismatch Scores=4,-5, Gap Costs=Existence: 12 Extension: 8, чтобы в поиск попали другие находки выдача была ограничена семейством Limapontiidae и из неё был исключён род Alderia sp. Единственный параметр, который отличался от дефолтных во всех трёх алгоритмах - число выдаваемых последовательностей, чтобы поиск не ограничивался 100 последовательностями и можно было понять, отличается ли число выдаваемых последовательностей для разных алгоритмов.
В находках содержатся только представители семейства и не содержатся представители рода Alderia, находок для последовательности цитохром-оксидазы моллюска с помощью изменённого blastn больше на 9 штук. Выдачи особо не отличаются, просто в каждой из них разное количество последовательностей, и находка Ercolania felina megablast'ом выдаётся 18, а другими алгоритмами 15. К тому же megablast первыми 17 последовательностями считает те, которые принадлежат Placida dendritica и 19 выдаёт Olea hansineensis, которая blastn считается 22. Оба варианта blastn выдают второй последовательность организма Aplysiopsis minor. В общем, различия наблюдаются в порядке и количестве последовательностей в выдаче, очевидно что тот алгоритм, который в целом выдаёт больше последовательностей, находит те последовательности, которые другие алгоритмы не находят.
Таблица с количеством последовательностей, найденных разными алгоритмами

Алгоритм	Число находок для последовательности из 6 практикума	Число находок для CDS вируса из предыдущего практикума
blastn с параметрами по умолчанию	95	865
blastn с изменёнными параметрами	104	977
megablast	24	69

Для поиска по CDS вируса была выбрана последовательность, кодирующая элемент его оболочки, предположительно малую субъединицу терминазы. Три используемых алгоритма были теми же. Верхние последовательности выдачи для megablast и blastn с параметрами по умолчанию не отличаются, а для подкрученного blastn порядок немного изменён, первая в выдаче двух других алгоритмов последовательность находится где-то далеко, а последовательности, которые в выдаче других алгоритмов в первые 10 не входят, вошли в первые 10. Оба варианта blastn находят совпадения только с клеточными организмами, причём как с бактериями (и далеко не только Клостридиями, которые поражаются этим фагом, но и абсолютно неродственными), так и с эукариотическими организмами. Обычный blastn находит крайне мало последовательностей фагов, по одной находке для каждого фага, геном которого попал в выдачу, тогда как для бактерий число находок достигает нескольких сотен, а для эукариот десятков. Blastn с изменёнными параметрами - то же самое, причём для Myoviridae, к которым принадлежит фаг, чей ген мы использовали, находок всего 10, а для Siphoviridae - 19 (возможно, связано с количеством записей для каждой клады вирусов в базе). Megablast уже находит только вирусные последовательности и последовательности Клостридий, которые этим фагом заражаются, и вообще находок для него меньше. Покрытие больше 90% для почти всех находок megablast, потому что он, если я правильно поняла, находит локально схожие участки. Варианты blastn выдают даже те последовательности, покрытие с которыми очень мало.

Задание 3. Поиск гомологов белков в неаннотированном геноме.

Для выполнения задания я взяла три белка, которые, как мне казалось, должны присутствовать у всех эукариот: гамма-субъединицу тубулина, гистон H3 и топоизомеразу 1. В неаннотированном геноме я искала гомологи белков Saccharomyces cerevisiae, потому что геном принадлежит грибоподобному организму и логично предположить, что ближе всего к его белкам окажутся белки грибов, а дрожжи наиболее исследованные представители Fungi. Последовательности белков дрожжей были найдены в UNiProt по ключевым словам - названию организма и английским названиям белков, а потом скачаны в формате fasta. Использвоался алгоритм tblastn, потому что его обычно применяют для поиска белков в геноме. Для поиска гомологов использовались следующие команды:
makeblastdb -in X5.fasta -dbtype nucl
tblastn -query P53378.fasta -db X5.fasta > gamma_tubulin.out (для других белков по аналогии)
Чтоб понять, можно ли говорить о гомологичности белков, я обращала внимание на длину построенных выравниваний, их вес, E-value, процент идентичности.
Гамма-субъединица тубулина, тубулин - структурный белок микротрубочек, специфичный для эукариотических организмов, входит в состав центра организации микротрубочек, а значит, участвует в их сборке, поддержании формы клетки, делении и т.д. Выдача для тубулина содержит 6 находок, последняя из которых имеет крайне маленький вес (29,6) и слишком большое Е-value, что не позволяет считать её достоверной, к тому же она очень короткая. Другие находки имеют приемлемую длину и приемлемые значения веса и E-value, но обладают низким процентом идентичности (не выше 39%), поэтому нельзя утвержать, что в геноме есть гены, кодирующие гомологичные белки, выполняющие те же функции.
Гистон H3 входит в состав нуклеосомы, то есть помогает ДНК скрутиться в хроматин, регулируя тем самым её транскрипцию, репликацию и т.д. Выдача для гистона сожержит находок, четыре последних имеют слишком маленький вес и слишком большую вероятность оказаться случайными, к тому же они короткие. А вот первые две имеют одинаковый вес (232) и E-value (4е-70), приемлемую длину и высокий процент идентичности (88%), а значит моэно сделать вывод, что гомолог гистона Н3 у организма есть и вполне вероятно что он выполняет ту же функцию. Возможно, его ген был дуплицирован, потому что два участка генома одинаково успешно выровнялись на последовательность белка, или же в сборке генома набор ДНК диплоидный, что сильно более вероятно. Гистон является наиболее консервативным из всех трех выбранных мной белков.
Топоизомераза 1 разрезает связи между цепями ДНК, тем самым раскручивая двойную спираль и делая возможными репликацию, трансляцию и другие процессы. Так же она обладает репаративной активностью и способна вносить одноцепочечные разрывы. Выдача для топоизомеразы содержит всего 3 выравнивания, последнее из которых имеет ужасно большой E-value и маленький вес, то есть является случайным. Два других имеют 0 E-value и вес 585-582, нормальную длину и высокий процент идентичности (у лучшего 49%), значит, в геноме присутствуют гены гомологов топоизомеразы, что неудивительно, учитывая её необходимость в клеточных процессах. Сборка, скорее всего, диплоидная, поэтому находки две (как и для гистона), а разные веса и процент схожести они могут иметь из-за вариативности алллеля, не влияющей на выполнение функции белка.

Задание 4. Поиск гена белка в контиге.

В геноме мексиканской амбистомы белки неаннотированы, поэтому я взяла тот же контиг, который в прошлом практикуме предлагался к скачиванию. Поиск проводился при помощи blastx, тк мы ищем транскрипт нуклеотидной последовательности в протеомах, и был ограничен таксоном Chordata. На изображении видно, что большинство белков в выдаче имеют статус PREDICTED, что не позволяет уверенно утверждать их функцию, или retrotransposone-like, что может указывать на их принадлежность вирусам. Единственный белок из 100 последовательностей в выдаче, который не является вирусным и имеет установленную функцию - receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma-like, принадлежит семейству тирозиновых фосфатаз - сигнальных молекул, регулирующих такие клеточные процессы, как клеточный рост, митоз, дифференциация, онкогенная трансформация. Последовательность принадлежит лучепёрой рыбе Ханос (Chanos Chanos).

Здесь изображено первое выравнивание с этим белком. Всего выравниваний построено 7 и их общая длина 2624 аминокислоты, общий вес 829 (максимальный вес отдельного выравнивания - 240), процент покрытия 8 (неудивительно, ведь мы выравниваем один белок на целый контиг длиной около 35 000 пар нуклеотидов), E-value 8е-89, то есть достаточно низкий, процент идентичности 47,45%. Причина того, что белок выровнялся не полностью, может быть в гомологичности отдельных доменов белков или в присутствии в гене интронов. Кроме того, хвостатые амфибии и лучепёрые рыбы не являются близкородственными и за время с тех пор, как эти группы разошлись, могло накопиться большое количество мутаций.