Чтение последовательностей по Сэнгеру

Задание 1


Файлы
  • прямая и
    • обратная цепи
  • Выравнивание прямой и комплементарной к обратной последовательности в проекте JalView
  • "Чистая" последовательность прямой цепи в формате fasta
    Оба файла, с хроматограммой прямой и обратной цепи, были открыты в программе Chromas Lite.
    Обратная цепь была изменена на комплементарную и перевернута (опция reverse complement), чтобы можно было сравнивать последовательности обеих цепей.
    С помощью опции find последовательности были выровнены относительно друг друга.
    Затем были определены границы нечитаемых 5'- и 3'-участков в каждой последовательности. Координаты определялись по прямой цепи.
    Необходимо заметить, что после удаления нечитаемых участков нумерация нуклеотидов автоматически изменилась, так что приведенные координаты соответствуют исходным файлам, но не соответствуют файлам, полученным в ходе дальнейшей работы.
    Границы нечитаемых участков:
    Прямая цепь
    Начало прочтения: 0-98
    Конец прочтения: 680 - до конца
    Обратная цепь
    Начало прочтения:0-152
    Конец прочтения: не представлен на прямой цепи

    Далее нечитаемые 5'- и 3'- концы были удалены.
    Характеристика качества хроматограмм
    Прямая цепь
  • В среднем сигнал превосходит шум в 9 раз.
  • Средняя сила сигнала вдоль оси X равномерна, сила шума увеличивается к концу хроматограммы приблизительно в 2 раза.
  • Сила у разных очевидных сигналов может различаться в 6 раз. При этом G и A чаще других нуклеотидов имеют очень сильный или очень слабый сигнал, в то время как T и C имеют меньший разброс силы сигнала.
    Обратная цепь
  • В среднем сигнал превосходит шум в 10-12 раз.
  • Средняя сила сигнала вдоль оси X равномерна, сила шума увеличивается к концу хроматограммы приблизительно в 3-4 раза.
  • "Клякса" на участке 720-730
  • Хроматограмма в целом неплохая.
    Редактирование последовательностей
    Для начала следует привести пример хорошего участка, прочтение которого однозначно:


    >
    Рисунок 1"Хороший" участок хроматограммы. Прямая цепь наверху, обратная внизу. Видно, что quality values высокие.

    Редактирование прямой цепи

    Проблема 1. Наложение пиков

    Программа не смогла прочесть 315 нуклеотид в прямой цепи. Последовательность однозначно восстанавливается по обратной, в которой проблем в данном месте нет.


    Рисунок 2 Прямая цепь вверху, обратная - внизу.

    Проблема 2. Сильный шум и вновь наложение пиков.
    На представленном участке прямой последовательности наблюдается большая высота пиков и их наложение друг на друга. Сопоставляя участок с участком обратной последовательности, видим, что программа прочла все верно.


    Рисунок 3 Прямая цепь вверху, обратная - внизу.

    Проблема 3. Шум выходит на уровень сигнала.

    Программа не смогла прочесть 504 нуклеотид прямой цепи. Он восстанавливается при сопоставлении с обратной.


    Рисунок 4 Прямая цепь вверху, обратная - внизу.

    Редактирование обратной цепи

    Проблема 4. Сильный шум на фоне слабого сигнала.

    Программа не смогла прочесть 24 нуклеотид обратной цепи. Он восстанавливается при сопоставлении с прямой.


    Рисунок 4 Обратная цепь вверху, прямая - внизу.

    Задание 2


    Требовалось привести пример нечитаемой хроматограммы

    Рисунок 5 Участок хроматограммы, в котором программа не смогла прочесть практически ни один нуклеотид. Взят файл WS2943_SP6R.ab1

    © Козлова Анастасия, 2015