1. Выбор белка

В окне расширенного поиска на сайте UniProt в поле «Organism [OS]» я ввёл название изучаемой бактерии с её TaxID: Francisella tularensis subsp. novicida (strain ATCC 15482 / CCUG 33449 / U112) [401614]. Поиск выдал 4124 записи. Чтобы сузить выбор до функционально значимых молекул, в боковом меню я применил фильтр «Proteins with: Catalytic activity» (белки с каталитической активностью), что сократило список до 420 находок. Для выбора наиболее изученного объекта я отсортировал результаты по убыванию оценки аннотирования (Annotation score). Моё внимание привлёк белок с высокой для данного организма оценкой «5 из 5» — CRISPR-associated endonuclease Cas9. Он был выбран для дальнейшего анализа, так как является ключевым ферментом системы адаптивного иммунитета бактерий и представляет огромный интерес для современной генной инженерии.

2. Информация о белке

Как уже было упомянуто ранее, для анализа была выбрана система CRISPR-Cas9. CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeat — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) — это адаптивная иммунная система, обеспечивающая защиту от мобильных генетических элементов (вирусов, мобильных генетических элементов и конъюгативных плазмид). Кластеры CRISPR содержат спейсеры — последовательности, комплементарные предшествующим мобильным элементам, — и нацелены на вторгшиеся нуклеиновые кислоты. Кластеры CRISPR транскрибируются и преобразуются в CRISPR РНК (crRNA). В системах CRISPR II типа для корректной обработки пре-кРНК требуется транскодируемая малая РНК (tracrRNA), эндогенная рибонуклеаза 3 (rnc) и этот белок. TracrRNA служит направляющей для обработки пре-кРНК с помощью рибонуклеазы 3. Затем Cas9/кРНК/tracrRNA эндонуклеолитически расщепляет линейную или кольцевую двухцепочечную ДНК-мишень, комплементарную спейсеру; в отсутствие двух направляющих РНК (gRNA) Cas9 неактивен. Cas9 распознает короткий мотив в повторяющихся последовательностях CRISPR (PAM, или мотив, примыкающий к протоспейсеру), что помогает отличить «свой» белок от «чужого», поскольку в бактериальном локусе CRISPR нет PAM. Распознавание PAM также необходимо для каталитической активности.

3. Кластеры похожих белков

Для данного фермента известно, что размер кластеров UniRef100 состоит из трех белков, а UniRef90 состоит из пятнадцати белков, в то время как в состав кластера UniRef50 входит целых 23 белка. Это говорит о том, что данный белок является довольно нераспространённым (в каком-то смысле уникальным), а также неконсервативным, так как количество белков, последовательности которых совпадают на 50 процентов (UniRef50) значительно превышает количество белков, совпадающих по последовательности с исходным ферментом на 90 и 100 процентов (UniRef90 и UniRef100, соответственно).

4. Посковые запросы

Первый запрос был составлен в режиме продвинутого поиска с заполнением полей Protein Name [DE] (CRISPR-associated endonuclease Cas9) и Taxonomy [OC] (Francisella). Идея заключалась в том, чтобы оценить распространенность данного белка в пределах рода Francisella. По итогам поиска выяснилось, что только у Francisella tularensis subsp. novicida имеется аннотированная запись Cas9 в базе Swiss-Prot (статус Reviewed), в то время как для остальных представителей рода записи на данный момент существуют только в TrEMBL. Аналогично, для всех бактерий (Taxonomy [OC]: Bacteria) было выявлено, что этот фермент представлен лишь ограниченным числом аннотированных в Swiss-Prot записей по сравнению с общим массивом данных. Это подтверждает, что, несмотря на известность системы CRISPR-Cas9, детально верифицированных и экспериментально подтвержденных записей этого белка в базе данных не так много.

Второй запрос был составлен путем заполнения полей Enzyme Classification [EC] (3.1.21.-), Protein Existence [PE] (Evidence at protein level) и Taxonomy [OC] (Francisella). Запрос составлялся с целью выяснить, для каких представителей рода существование данной нуклеазы доказано экспериментально. Как выяснилось, для большинства записей белка указан уровень PE 3 (inferred from homology) или PE 2 (inferred from transcript), и лишь единичные записи имеют статус прямого доказательства на уровне белка. Это позволяет предположить, что функциональная активность Cas9 у многих штаммов предсказана на основе гомологии с уже изученными моделями, хотя записи в Swiss-Prot и проходят тщательную проверку кураторами.

Третий запрос имел целью выявить, насколько часто среди гидролаз порядка Thiotrichales (к которому относится Francisella) встречаются ферменты, требующие ионы магния в качестве кофактора (как и Cas9). Сначала были заполнены поля Taxonomy [OC] (Thiotrichales) и Keyword [KW] (Hydrolase), а затем добавлено поле Keyword [KW] (Magnesium). По первому запросу в базе Swiss-Prot было найдено 62 записи, а по второму — лишь 14. Из полученных результатов можно сделать вывод, что магний-зависимые гидролазы, к которым относится и Cas9, составляют лишь малую часть от общего числа аннотированных гидролаз данной группы. Таким образом, рассматриваемый белок принадлежит к функционально специализированному и относительно немногочисленному семейству ферментов в пределах своего таксона.