Учебники:
Гистология Авторы: Ж. Карнейро, Л. К. Жункейра
Афанасьева, 5-ое издание, учебник для медиков под медицинскую программу.
Практикум - главное. Рисунками можно использовать на экзамене.
На экзамене дается препарат и микроскоп, его нужно целиком описать.
Преподаватели: 401 Ганчарова Ольга Сергеевна, 402 Мусинова Яна Рафаеловна. Шубина Мария Юрьевна.
Лектор: Евгений Валерьевич Шеваль.
Ткань - интуитивно понятный термин, есть множество классификаций тканей.
По сути, всего тканей 4:
1. Эпителиальная - покровы или “отшнуровывающаяся” от желез,
2. Ткани внутренней среды - кровь, кость, соединительная ткань, хрящ,
3,4. Специализированные ткани - нервные, мышечные.
Кроме самих клеток важно межклеточное вещество, организованное по-разному в разных тканях.
Ткань надо понимать. Смотря в микроскоп, видим основные типы клеток и тип соединительного вещества. Это и определяет тип ткани. Логично, без зазубривания.
Существует современная и классическая гистология. Поразительно, но именно классическая - изучение ткани на срезах - остается самым полезным и популярным методом.
Пример, хотим изучить сердце с гистологической точки зрения. С помощью зонда делаем биопсию печени (самого горячего органа, кстати). Тонко нарезаем печень. Она мягкая, поэтому нарезать очень тонко не получится не зависимо от инструмента. Из-за этого нужно залить смолой.
Существует много смол. Гистомикс, парапласт, парафильм, например.
В воде залить не получится, так как все смолы - гидрофобные. Надо заменить воду на этанол, например.
На живых клетках проводить подобное нельзя. Поэтому необходимый шаг - фиксация. Бывает альегидная (на белки) и спиртовая. Часто белки надо вообще вымыть из образца. Для этого служить спирт с уксусной кислотой. Формальдегид наоборот, белки сшивает.
Т.о. шаги:
1. Фиксация.
2. Обезвоживание. Заменяем спирт на капсиол, тоулол. Далее постепенно заменяем на смесь парафильма и ксилола.
3. Нарезка - микротомом. Толщина срезов обычно 5-6 мкм, можно даже 2-3 мкм.
4. Регидратация. Опускаем в ксилол, в спирт, в сильно разбавленный спирт, потом в воду.
5. Покраска, например, гематоксилином (он водорастворимый, для этого регидратировали).
6. Коэффициент преломления образца должен быть 1.5 где-то, как коэффициент преломления стекла. Если как воды - 3, то картинка будет мутной, т.к. оптика просто не приспособлена для работы с водяными растворами. Водяной объектив - для прижизненных наблюдений, стоит больших денег. Надо перевести все из водяной среды в новую. Следовательно, обезвоживание - обязательный этап приготовления препарата.
7. Закрепление.
Другой вид препаратов - полутонкие срезы - от 250 нм до 2 мкм срезы. Нужен другой тип срезания - на стеклянном ноже. Плотность образца должна быть больше, поэтому используют эпоксидную смолу. Но эту смолу уже нельзя вымыть. Поэтому красить полутонкие срезы можно с трудом.
Зато с его помощью можно посмотреть детальный срез. Покраска - метиленовым синим. Такой препарат будет только один в программе.
Далее можно использовать электронную микроскопию, хороший инструмент гистологии.
Еще можно замораживать образец. Нужен жидкий азот и стаканчик с пентаном. Если бросить кусочек среза в стаканчик - он быстро и хорошо замерзает. Этот метод дает препараты не лучшего качества.
Качество препарата не всегда важно. Например, цитобиопсия в медицине - при операции отрезают кусочек органа, который гистолог быстро замораживает, быстро делает срез, красит гематоксилином, ставит оперируемому пациенту диагноз, далее хирург продолжает протокол с корректированным диагнозом.
Но, при всей стандартной процедуре вымоются жиры. Они тоже гидрофобны. Если хочется их сохранить, тоже можно использовать замороженные срезы.
Еще нужно учитывать, что парафин расплавленный, белки из-за высокой температуры денатурируют. Выявить их антителами больше нельзя. (Разрушены антигенные детерминанты.) Выход - снова метод заморозки.
Красители: делятся на специфические и высокоспецифические. Например, выявление коллагена или эластина. Неспецифичные - гематоксилин (фиолетовый), эозин (оранжевый, красит кислые компоненты, цитоплазму).
Если большое хорошо прокрашенное ядро, значит, транскрипционно активно. Значит, что-то производится в клетке. По ЦП можно понять, чего именно клетка производит. Т.о. делается вывод о типе и особенностях ткани.
Если видна ярко-оранжевая клетка, то внутри много кислого белка. М.б. глюкозаминогликаны, но их обычно не много. Это могут быть эритроциты, набитые кислым гемоглобином.
Кроме того может быть еще много разных специфичесикх и неспецифических красок.
Азан, ... много других - не надо знать все названия и особенности. Зато можно предположить по форме и цвету препарата, что окрашивает; далее логически определить, что это за ткань, какая плотность веществ.
Есть красный краситель на коллаген, самый распространенный белок нашего организма. Коллагена много в соединительных тканях, особенно - в кости. (В эпителиальных - много самих клеток)
Кость еще пропитана всякими неорганическими соединениями для придания прочности. Но главное - коллаген, который можно красиво покрасить.
Как сделать срез кости? Сначала вымыть всю твердую органику. Убираем кальций с помощью ЭДТА. Еще можно с кислотой и под током. При этом по ходу процедуры надо периодически взвешивать кость до выхода на плато. В случае ЭДТА кость может начать набухать.
Для выявления специфических белков проводится имунноблот. Проявляют фосфатазой, например. Можно использовать различные гистохимические реакции. Можно даже мерить активность фермента на срезе. Например, измерение активности сукцинатдегидрогеназы.
Гибридизация in situ ДНК и РНК - совсем обычные методы.
Есть экзотические методы “из книжек”, которые в наше время уже не используются.
Метод проточной цитофлуорометрии. Сортер - позволяет отбирать клетки.
Изучение ткани в живом организме - для того, чтобы не брать биопсию. К тому же в фиксате все по-другому и неправда.
А чтобы увидеть что-то в живом организме - флуоресцентный микроскоп, надо, чтобы все светилось. Можно вколоть краситель на ДНК. Можно трансгенное животное, у которого какие-то типы клеток светятся зеленым или красным.
Можно просто поставить под специфический промотор какой-то тип клеток.
Также здесь проблема с тем, что нельзя поставить объектив вплотную. Более того, ткани поглащают сигнал. Но! Они пропускают красный цвет. Следовательно, краситель должен быть светящимся в глубоко красном свете. Красный флуорофор “Катюшка”.
Закрепление мышки резиновыми петельками, светим и смотрим красный свет.
Метод прижизненных наблюдений - гораздо лучше, чем исследовать, например, опухоли, на разных стадиях развития (придется из исследуемой группы организмов периодически убивать несколько мышек, едлать срезы..). Зато, для прижизненных наблюдений требуется большая предварительная работа.
Также требуется необычный микроскоп.
Вообще, можно брать орган или снимать кожу и смотреть на орган... Сейчас научились подбираться практически к любому органу.
Мультифотонный микроскоп - не нужен в клеточной биологии, например.
Вообще,под понятием “гистолог” понимаются 2 разных человека:
1. Гистотехник, лаборант-гистолог - делает препараты, никогда на них не смотрит. Отличается от обычного инженерного лаборанта тем, что всю жизнь остается высококвалифицированным лаборантом.
2. Гистолог-специалист, патогистолог - смотрит на препараты, проводит анализ, почти никогда не делает препараты.
Для чего нужны знания патогистологии? Для мониторинга здоровья подопытных животных, например. Вообще, до 70-х годов прошлого века все эксперименты были грубыми, животные могли быть нездоровыми.
Но сейчас для исследований нужны SPF-звери (specific pathogen free, стерильные звери в том смысле, что они чистые и без болячек/паразитов).
Патоанатомия - это вскрытие для выяснения диагноза. Иногда учеными проводится намеренная токсикация - хроническая (постепенная) или летальная (для определения смертельной дозы).
Моделирование заболевания - сложная вещь. Например, атеросклероза, которые нельзя смоделировать на мышах - у него его просто нет. Для определения соответствия модели заболеванию существуют патоморфологические шкалы.
Один их популярных видов статей в гистологии - case report, который редко встречается в других областях.
Артефакт эксперимента - все, привнесенное в препарат искусственно. Самый неизбежный и неисследованный - артефакт смерти из-за агонизации животного. Убить единовременно до сих пор не получается.
При фиксации важно, чтобы проникновение фиксатора в препарат было максимальным (иначе возможно гниение и аутолиз). Для этого надо:
1. Максимально измельчить препарат, не более 0.5 см по одному измерению.
2. Объем фиксатора не менее 20 объемов препарата. Лучше перелить фиксатор.
3. Фиксация длится более 1 дня, но не более 2 дней, иначе формальдегид сошьет все белки.
Глубокая заморозка почти не встречается на практике. Её нужно проводить на очень больших, труднодостигаемых температурах, а на -20 появляется артефакт заморозки.
Особенности формальдегида. Формальдегид 10 и 4 процента - одно и то же, такая двойственность происходит из-за того, что для получения 10-ного формальдегида разводят в 10 раз 40-ный формальдегид.
Также формальдегид бывает кислый - на воде, не используется; и нейтральный - на фосфатном буфере с pH 7.0.
Другие фиксаторы - фиксатор Буэна,фиксатор Корнуа.
Фиксатор Буэна хорош тем, что не разъединяет клетки так, как формальдегид, т.е. минимизирует артефакты. Но зато вымывается с трудом, на него приходится тратить много спирта.
Если в образце требуется оставить жир - нельзя пользоваться спиртом ни на одном из этапов.
Гликоген, например, растворим в воде и особенно хорошо - в формальдегиде. Следовательно, для его сохранения нельзя фиксировать в формалине.
Фосфолипиды и воска, к счастью, не вымываются.
Часто в методиках можно встретить этап промывания “в водопроводной воде” - идеальный раствор воды с солью.
Далее по методике обычно следует этап вырезки части препарата и его помещение в кассету.
Далее - проводка препарата. По этапам дегидратации, пропитки парафином... Ученые улучшают методики как могут, некоторые используют даже проводку через Fairy.
Этанольная проводка - встречается редко, т.к. получить и хранить 100-ный спирт - трудоемко. Изопропанольная фиксация - традиционна.
Кстати, варка - наиболее простая фиксация.
Тинкториальные свойства - как что-то окрашивается каким-то образом.
Окраска может быть - ортохроматической, метахроматической (с изменением цвета); базофильной (гематоксилином, реакция которого на фосфаты, кстати, до сих пор не объяснена, но в целом носит название “образование лаков и протрав на фосфатах”), оксифильной (в широком смысле, кислыми красителями, = ацидофильная окраска), эозинофильной (только эозином, более узкое понятие).
Пример “гистологической логики”: ЦП сильно базофильна, значит, много РНК, значит, много рРНК, значит, усиленная экспрессия.
Качественная реакция на жир - необходимо знать - это судан-3, можно посмотреть на препаратах.