Опыты Чарльза и Френсиса Дарвина

Чарльз выяснил, что растения тоже способны чувствовать (на экспериментах с росянками).
Далее - опыты с затемнением зоны изгиба, апекса и целого растения - явление фототропизма - движение в ответ на неравномерное распределение света.
Механизмы были не ясны, высказана гипотеза наличия сигнального вещества.
Параллельно в Голландии, России и в Германии - ученые проверяли разные гипотезы - химический, электрический, механический (тургорный волны) или светооптический сигнал.
Взяли апексы и поместили на агар. Этот кубик агара наносили на деапектировнный стебель. (надо было ставить неравномено) Со стороны наложения располагалась большая дуга изгиба. Стало понятно, что этот сигнал - явно вещество. Было названо ауксином, ибо из экстракта его выделить было невозможно.
Позже ауксин был выделен из мочи вегетарианцев - концентрируются в почках - (?) кислота.

Чем выше уровень ауксина в растении, тем больше уровень роста. Если уровень низок - значит, с побеговой системой что-то не то, нужно регенерировать систему попбегов.

Корни выделяют вещества - цитокины, посылает сигнал по всему растению.
Аналогично - лист выделяет гиббереллины.
Стебель для себя синтезирует немного цитокина, а корень - ауксина. Но это для себя, для локальных целей, без распространения.

Эффекты ауксина

1. Аттрагирующий эффект - растение старается “подкормить” то место, где есть ауксин. В норме концентрация акусина растет к апексу.
2. Субапикальная зона - нужна для растяжения. Ауксин и вызывает растяжение, равномерное или нет.
3. Дифференцировка прокамбия и ксилемы - аттрагирующий эффект дистантный (аналоги васкуляризации у животных). Растягиваться может только ранняя стадия развития ксилемы. А метаксилема растягиваться уже не может.
4. Апикальное доминирование - питательные вещества направляются в основном в терминальный апекс, а не боковый. Обеспечение сна не главных почек.
5. Деление клеток камбия и дифференцировка ксилемы - аттрагирующий эффект.
6. -"-

Ауксин: строение, биосинтез и деградация

Индолилуксусная кислота (ИУК) - необходимо разделение зарядов. Мажорный ауксин, синтезирующийся как в пластидах, так и в цитозоле. Обычно синтезируется из Trp.
Индолилмасляная кислота - встречается у некоторых растений, предшественник ИУК.
Хлориндольная кислота - у бобовых.
Фенилуксусная кислота - тоже обладает ауксиновой активностью.

В опытах по отключению биосинтеза триптофана, выяснилось, что есть обходные пути - нетриптофановые.

Депонирование - в виде ИУК-гликозидов, м.б. комплексы с белками и а.к.

Окисление - необратимое, в случае, когда ИУК очень много. ИУК-оксидаза - высокоспецифична. Пероксидаза - неспецифична, оксиление ИУК - случайная побочная роль.

При синтезе важен сам индол, можно и не доводить до триптофана. Т.о. здесь можно варьировать путь.
Сначала может произвойти дезаминирование, дезаминирование, а затем окисление альдегида - всего 3 феремента. В некоторых случая возможно доминирование сталии декарбоксилирования.

Крестоцветные - богаты на серный метаболизм, именно с ними и приходится работать ученым (Arabidopsis). У них путь осуществляется через серные производные.

Еще есть интересный вариант - окислительное декарбоксилирование - скоростной путь. Его используют бактерии. Промежуточное вещество - индолацетомид - не узнается ферментами растения.

Обратимая инактивация ауксинов - присоединения сахара (возникновение стерических затруднений), аминоксилоты или более сложных конъюгатов. Нужна для того, чтобы растение “пробуждалось” после “спячки”, когда нет времени проходить полный путь синтеза.

Катаболизм ауксинов -
1. до индолил-муравьиной кислоты,
2. оксиление самого индольного кольца.

РЕЦЕПЦИЯ ауксинов

1. Самый первый найденный рецептор на ауксин - ABP1, около 22 кДа, у разных растений - разное количество генов.
2. Транспортеры ИУК
3. ABP 60 кДа - гликозидаза цитокининовых коъюгатов, активируется аллостерически. Не рецепция, а аллостерия. Т.о. цитокинин усиливается под действием ауксина.
4.ABP GST - глутатион-5-трансфераза. Обработка ауксином влияет на ROS. GST поддерживает редокс-статус, удаляя H2O2. GST контролирует многие процессы в клетке.
5. TIR1 - transport inhibitor response 1 - белок, входящий в убиквитин-лигазный комплекс. Внутриядерный, активируется, когда TIR1 связывается с ИУК. Вылавливает строго определенные белки ядра (AUX/IAA), вызывает их убиквитинилирование, а далее - деградацию в протеасоме.
6. Мишени ИУК в ядре - AuxRE, последовательности в геноме. Auxin-response factor не связывается с AuxRE в присутствии Aux/IAA (репрессор). Связываение становится возможным в присутствии ИУК.
Каждый AuxRF - небольшие семейства, на разные промоторы. В один момент времени представлены не все семейства AuxRF в клетке. Ответ на ауксин очень быстрый, всего 5-10 минут.

Подробнее про рецептор ауксина ABP-1 - на мембранах ЭПР, немного на наружней мембране.
Связывание ИУК приводит к отшуровыванию везикул, активации везикулярного транспорта. Протонная АТФаза в составе везиул встраивается в мембрану, вызывает закисление клеточной стенки. Также нмного меняется активность липаз, происходит высводобдление инозитолтетрафосфата (как инозитолтрифосфата у животных).
В течение 60 секунд - освобождение инозитидов лидами мембран.
Внутри везикул могут быть и другие вещества, влияющие на клеточную стенку.

Строение клеточной стенки:
микрофибриллы целлюлозы (из 100 нитей целлюлозы, паракристалл);
сшивочные гликаны (ксилоглюканы, арабиноксилологлюканы и т.п.) - образуют связи друг с другом и с фибриллами целлюлозы за счет водородных связей, обеспечивают образование единого матрикса;
белки, похожие на коллаген - пролин-богатые, глицин-богатые, гидроксипролин-богатые - экстензины;
пектины - связывают атом Ca2+ в местах кальциевых замковых зон, связывают пектин в пектиновую сеть, которая независима от целлюлозной, но иногда может образовывать с ней сшивки.

Растяжение клеточной стенки под воздействием ауксина - кислый рост, длится 30 мин. Для того, чтобы растяжение было “застывшим” - клетка должна быть живой.
В корнях на ауксин наблюдается наоборот, подщелачивание мембраны.
В составе везикул выбразываются также экспансины - белки, ползущие по фибрилле и очищающие её от сшивочных гликанов, рушат водородные связи, обеспечавают расхождение фибрилл. Экспансины - целое семейство белков, у всех разные функции в растении, бывают специфическими в зависимости от нужд клеток.
XET - ксилоллглюкан-эндотрансгликозилазы - рвут гликлозидную связь внутри гликаноа. XET перекидывает ковалентную связь через себя на что-то еще.
Пектинметилэстеразы - метилируют/деметилируют пексин - т.е. разжижвют/сжижают мембрану.

Таким образом, рецепция обеспечивает комплексную реакцию организма.

Реакции всего организма

Если света мало - растение “ползет” к свету.
Если света много - растение наклоняется в сторону света.
При боковом освещении получается, что ауксин располагается на темновой зоне. От этого зависит степень растяжения.
Отличия роста астений от животных - клетки не могут открепиться друг от друга, клетки растут симпластно - без разрыва контактов. Ауксин решает задачу согласованности роста, чтобы не возникало разрывов (которые невосстановимы для растений).
Репортерный ген глюкоронидазы, реагирует на ауксин, можно посмотреть его активацию.
Перераспределение обеспечивается системой транспорта ауксинов. ИУК входит через AUX1, пассивный вход для незаряженной формы. В клетке он диффундирует в вида аниона (депротонирован). Заряд на мембране используется для переведения ИУК против градиента концентрации.
Важную роль играет кортикальный цитоскелет. Видимо, белок-переносчик образует надмолекулярный комплекс. Возможно, PIN1 связан с везикулярным транспортом.
Ген PIN-переносчика находится под действием ИУК. Если нарушить систему экспонирования PIN, растение не может развиваться полярно.

Интересно, что избыток ИУК приводит к ослаблению потока PIN, а следовательно, и транспорта ИУК.
Вообще, регуляция транспорта ауксинов - очень сложный процесс и система.

Вывод ИУК - в сторону только одного соседа. Возникновение ряда клеток. Которые организуют векторный поток. Этот вектор очень трудно сбить.
Транспортная система для конъюгатов в ИУК - может направлять вещества в вакуоль, или из клетки.
В растении существует система параллельного транспорта конъюгатов и активной формы ауксина.

Рассмотрим семейство белков PIN.
PIN1. Мутация pin1 - возникновение тонкой палочки вместо стебля, листья неправильной формы - ауксин не может транспортироваться направленно. Мутант неправильно ориентируется к свету, заваливается. Важен для формирования цветоноса. Уже в эмбрионе наблюдается экспрессия белка PIN1, по мере нарастания биомассы - канализация потоков ауксина. Семядоля в виде блюдца, также вызывается мутацией CUC (cup-shaped cotyledon).

В кончике корня образуется обратный поток ауксина. PIN1 транспортирует ауксин вдоль центрального цилиндра. Попадание в покоящийся центр. PIN4 - экспрессируется в клетках покоящегося центра. Далее - попадание в корневой чехлик.
PIN7 и PIN3 распределяют ауксин по бокам клеток и корня. Когда колумелла корня покинута, клетки эпидермы и иже с ними обеспечивают транспорт ауксина вверх.

В стебле ауксин - “архитектор” растения. Создает проект будущих частей растения, вызывает дифференциацию меристемы. Будущие листья возникнут там, где наибольшее скопление ауксина. Вдоль потока ауксина будут формироваться проводящие элементы.
Мутанты pin1 не могут образовавыть листья сами, т.к. не могут концентрировать ауксин. Если положить пасту с ауксином на какую-то точку - возникнут лист.
Если подействуем механическим фактором - что-то изменится, но запуска меристемы не произойдет.

Механические свойства меристем - с помощью луча лазера и частицы-зонда с микроманипулятором. Этот метод позволил выянить, что все клетки меристемы обладают одинаковыми механическими свойствами. Откуда тогда возникаютт листья?
Оказалось, что если брать более крупную частицу-зонд, будет пружинить целый слой клеток. Выяснилось, что глубинные слои отвечают за размягчение.
Т.о. растяжение клеток начинается из глубин клеток.

В клетках меристем низко содержание Ca, важную роль разрыхления играет пектинметилэстераза (PME). На нее есть ингибитор PMEI.

Т.о. ауксин начинает сложную механическую игру в растении.

Семинарское занятие. Строение растительной клетки. Особенности.

1. Из необычных орагноидах - пластиды - происхождение от цианобактерий, кольцевая ДНК 150-250 kbp. ХП ДНК составляет приблизительно всей ДНК клетки. Рибосомы 70S-типа - прокариотические, чувствительные к канамицину, хлорамфениколу, например. Сплайсинг есть, в том числе альтернативный и транс. Оперонная структура. Наличие инвертированных повторов.
Типы пластид - лейкопласты, хлоропласты, амилопласты, геронтопласты, пропластиды. Тип пластид контролируется ядром, сигнал для всех одинаков, поэтому тип пластид один на клетку.
Основные фунции: ФС, экологический фунции - цвет для привлечения насекомых или предупреждения о несъедобности, запас крахмала (только в пластидах), синтез ЖК, синтез Trp, переработка нитритов и нитратов, синтез гормонов.
Продукты ФС: крахмал (осмотически интертен, но нетранспортируемый и запасается только в пластидах), сахароза (до по массе, если бы была глюкоза - случился бы карбонильный стресс, хранение в большой центральной вакуоли, по сравнению с глюкозой то же количество осморическое давление будет в 2 раза меньше; на сахарозу можно нацепть еще групп, еще больше понизить осмотрическое давление), сахароза + галактоза = раффиноза, раффиноза + галактоза = стахиоза, стахиоза + галактоза = вербаскоза - транспортные формы сахаров - понижение осмотического давления;
2. Большая центральная вакуоль. Наличие большого количества сахарозы внутри вакуоли обеспечивает привлечение воды - осмотичское давление P.
3. Клеточная стенка для того, чтобы клетку не разорвало.
Состав - целлюлоза, сшивочные глюканы, пектинов (имеют - заряд, задерживают +, т.е .катионы металлов Ca, Fe), белки (структурные и ферменты), белки-хелаторы железа.
Давление клетки на клеточную стенку - и есть тургор. У флоэмы толщина стенки больше,чем у мезофилла.
4. Плазмодесмы. Фрагмент ЭПР, заключенный в плазмодесме - десмотрубочка, desmotubula. Регуляция потока по десмотубуле - с помощью сократимых белков - комплексов актина с миозином.
Для полной изоляции - закупоривание каллозной пробкой - в течение 5 минут.
Предел проницаемости плазмодесм - 20 кДа.
Обмен сигналом - тоже ограничен. Поэтому большие белки нужно разворачиваться и сворачиваться. На принимающей стороне ЦП должен затыкать шапероновый комплекс. На входе - анфолдинг-белок.
Обмен белками и РНК.
Во флоэме - ситовидные поля, есть медленный обмен потенциалом.
У растений больше РНК-вирусов, т.к. им легче проникать между клетками. Комплексная вирусная инфекция.
Изменение структуры плазмодесм по мере роста клеток. Увеличение длины, ветвление. Направление ветвления - обозначает направление транспорта.

5. Особенности деления. У животных перетяжка. У растений - образование пластинки из мтб, фрагмопласта из пузыриков с пектином и сшивочными гликанами. Такой способ нужен для сохранения контактов, сохранения плазмодесм (такой проблемы нет у хламидомонады, например, которая делится перетяжкой). Т.о. образуются первичные плазмодесмы.
Слои целлюлозы - параллельны, новый слой под новым углом.ТД целлюлозе выгодно лежать антипараллельно. Поэтому фермент должен образовывать надмолекулярные структуры так, чтобы целлюлоза сразу склеивалась, как нужно. Этот комплекс трансмембранный, ест сахарозу с одной стороны, фруктозу выделяет назад. При этом внутри фермента образуется UDP-глюкоза, достравивающая филамент с дргуой стороны мембраны. Таких компексов несколько подряд в мембране.
Если обработать растительную ткань пектиназой, произойдет разваливание на отдельные клетки. Если еще целлюлазы - отдельные протопласты, которые не будут лопаться при определенной ионной силе раствора.

Активные формы кислорода в клетке

В результате световой фазы ФС образуется кислород. Синглетный кислород - встречается только в растительных клетках как раз при участии хлорофилла.
Другие формы: супероксид-анион-радикал O (O2+e, ЭТЦ при перевосстановлении цепи, до всех e у растений, среднее время жизни), H2O2 (кислород + 2 e + 2 H; 2 супероксида + 2 протона = O2 + H2O2 - супероксиддисмутаза; максимальное время жизни), гидроксид-радикал (H2O2 = 2OH;самое короткое время жизни).
Триплетное состояние хлорофилла - время полужизни - в миллион раз длиннее полужизни синглетного хлорофилла. Рекомбинация кислорода с триплетным хлорофиллом приводит к образованию синглетного кислорода.

Антиоксиданты - те, которые сами окисляются так, чтобы не окислялись другие - аскорбиновая кислота (10 концентраций аскорбата ЦП), глутатион (в гидрофильной фракции), каротиноиды (мембран), ретинол (вит. A), -токоферол (витамин E), ненасыщенные жирные кислоты.

Неожиданные функции митохондрий у растений

Бета-оксиление - идет не в МХ, а в глоиксисомах.
МХ помогают клетке бороться с ROS, борются с NAD(P)H с помощью ЭТЦ.
Альтернативные НАДН-дегидрогеназы.
Альтернативная оксидаза.
ЦТК крутится по кусочкам, активны анаплеротические реакции.
Человек - геном 16-18 kbp, кукуруза - 500 kbp, дыня - 2000 kbp. У растений геном МХ - генная помойка клетки, очень вариабельный и нестабильный геном.