Практикум 5. Взаимодействия в структуре PDB 2X42

В данной работе проводится анализ нековалентных взаимодействий в белковой структуре PDB 2X42 — бета-глюкозидазе 3B из Thermotoga neapolitana (мутант D242A). Белок состоит из 715 видимых в кристалле аминокислотных остатков цепи A (полная последовательность — 721 остаток) и относится к семейству гликозидгидролаз GH3 с трёхдоменной архитектурой: N-концевой (β/α)₈-баррель, α/β-сэндвич и C-концевой домен фибронектина III. Метод получения — рентгеноструктурный анализ (разрешение 2.10 Å, pH 7.4). Все изображения получены в программе PyMOL с использованием команды ray.

1. Водородные связи, затрагивающие атомы остова белка

Водородные связи остова (N–H···O=C пептидной группы) формируют вторичные структурные элементы белка. В правой α-спирали каждый донор N–H остатка i образует водородную связь с карбонильным кислородом остатка i−4.

Для иллюстрации выбран участок α-спирали (остатки 92–110 цепи A, HELIX 5 в PDB), расположенной в N-концевом TIM-барреле. Атомы остова показаны палочками: синий — азот (N), красный — кислород (O), белый — углерод (C). Жёлтые штриховые линии — водородные связи N···O.

Водородные связи остова в альфа-спирали — Рис. 1. Водородные связи остова в α-спирали (остатки 92–110). Жёлтые штриховые линии — водородные связи N–H···O=C с расстоянием N···O ≈ 2.7–3.0 Å. Каждая связь соединяет остаток i с остатком i−4 (например, N104···O100: 2.70 Å; N105···O101: 2.82 Å).

Донор (N)	Акцептор (O)	d, Å	Δi
N(104)	O(100)	2.70	i−4
N(105)	O(101)	2.82	i−4
N(107)	O(103)	2.83	i−4
N(108)	O(104)	2.87	i−4
N(97)	O(93)	2.88	i−4
N(109)	O(105)	2.93	i−4

Все значения расстояний (2.7–3.0 Å) и паттерн i→i−4 однозначно подтверждают α-спиральную конформацию данного участка.

2. Водородные связи, затрагивающие атомы боковых радикалов аминокислот

Водородные связи между боковыми цепями играют ключевую роль в связывании субстратов. Для иллюстрации выбрана область активного центра: молекула α-D-глюкопиранозы (GLC) связывается в подсайте −1 через водородные связи с боковыми цепями нескольких остатков.

Водородные связи боковых цепей с GLC — Рис. 2. Водородные связи между боковыми радикалами аминокислот и молекулой α-D-глюкопиранозы (GLC, зелёный цвет). Пурпурные штриховые линии — водородные связи (d ≤ 3.5 Å). Показаны остатки Asp58, Arg130, Lys163, His164, Tyr210, Ser370, Glu458.

Остаток	Атом белка	Атом GLC	d, Å
Asp58	OD1	O6	2.53
Asp58	OD2	O4	2.58
Lys163	NZ	O3	2.79
Arg130	NH1	O2	2.81
His164	NE2	O3	2.81
Tyr210	OH	O1	2.88
Glu458	OE2	O2	3.34

Наиболее короткие водородные связи образует Asp58 (2.53–2.58 Å) — ключевой остаток подсайта −1. Glu458 — каталитический кислотно-основной остаток GH3; мутант D242A в данной структуре лишён нуклеофила.

3. Солевые мостики

Солевой мостик — электростатическое взаимодействие между отрицательно заряженными (Asp, Glu) и положительно заряженными (Arg, Lys) боковыми цепями (d ≤ 4.0 Å). В структуре 2X42 обнаружено 64 уникальных солевых мостика — значительное число, характерное для термостабильных белков T. neapolitana (оптимум роста ≈ 90 °C).

Обзор солевых мостиков — Рис. 3а. Общий вид белка с 8 наиболее короткими солевыми мостиками. Красный — Asp/Glu, синий — Arg/Lys. Оранжевые линии — расстояния ≤ 4.0 Å.

Солевой мостик Asp58-Arg64 крупным планом — Рис. 3б. Солевой мостик Asp58–Arg64 (d = 2.58 Å) в области активного центра. Asp58 одновременно участвует в солевом мостике с Arg64 и в водородных связях с субстратом GLC.

Остаток (−)	Остаток (+)	d_min, Å
Glu395	Lys444	2.49
Glu232	Arg187	2.56
Asp58	Arg64	2.58
Glu387	Arg527	2.60
Glu686	Arg718	2.64
Glu666	Arg660	2.65
Glu475	Lys427	2.66
Glu334	Lys632	2.71

4. Дисульфидные связи

Дисульфидная связь образуется между атомами Sγ двух цистеинов (d(S–S) ≤ 2.5 Å). В структуре 2X42 четыре остатка цистеина: Cys128, Cys161, Cys218 и Cys296. Записи SSBOND в PDB-файле отсутствуют.

Все цистеины, дисульфидные связи отсутствуют — Рис. 4. Все четыре цистеина белка 2X42 (жёлтые палочки, атомы Sγ — золотистые сферы). Красные штриховые линии — расстояния Sγ···Sγ между всеми парами. Минимальное расстояние — 13.48 Å (Cys161–Cys218), что во много раз превышает порог образования дисульфидной связи.

Пара цистеинов	d(Sγ···Sγ), Å	Вывод
Cys128 — Cys161	17.55	нет связи
Cys128 — Cys218	14.02	нет связи
Cys128 — Cys296	28.67	нет связи
Cys161 — Cys218	13.48	нет связи
Cys161 — Cys296	15.54	нет связи
Cys218 — Cys296	16.71	нет связи

Все четыре цистеина являются свободными. Это типично для внутриклеточных белков анаэробных термофилов, где окислительная среда, необходимая для образования S–S связей, отсутствует.

5. Стекинг-взаимодействия (π–π стекинг)

Стекинг — нековалентное взаимодействие между π-электронными системами ароматических колец (Phe, Tyr, Trp, His). Различают параллельный (face-to-face, угол нормалей 0–30°) и T-образный (edge-to-face, угол 60–90°) стекинг. Расстояние центроид–центроид при стекинге ≤ 5.5 Å.

В структуре 2X42 содержится 76 ароматических остатков. Поиск выявил 14 пар с расстоянием центроид–центроид ≤ 5.5 Å. Два типа стекинга задокументированы ниже.

Параллельный стекинг Tyr403/Phe432 — Рис. 5а. Параллельный (face-to-face) стекинг Tyr403 (синий) и Phe432 (красный). Расстояние центроид–центроид (зелёные сферы) — 3.78 Å, угол между нормалями — 5.3°. Это классический параллельный π-стекинг.

T-образный стекинг Phe469/Tyr470 — Рис. 5б. T-образный (edge-to-face) стекинг Phe469 (оранжевый) и Tyr470 (зелёный) в C-концевом домене. Расстояние центроид–центроид — 4.98 Å, угол — 83.2°. Плоскости колец взаимно перпендикулярны.

Все ароматические остатки белка — Рис. 5в. Все 76 ароматических остатков белка 2X42: Phe (фиолетовый), Tyr (пурпурный), Trp (синий), His (оранжевый). Ароматические остатки распределены по всей структуре, формируя стабилизирующую гидрофобную сеть.

Пара	d, Å	Угол	Тип стекинга
Tyr403 — Phe432	3.78	5.3°	Face-to-face (параллельный)
Tyr580 — Phe594	4.47	17.5°	Face-to-face (параллельный)
Phe469 — Tyr470	4.98	83.2°	T-образный
Tyr582 — Tyr583	5.39	76.7°	T-образный

Заключение

В структуре PDB 2X42 проанализированы пять типов нековалентных взаимодействий:

Водородные связи остова — обнаружены; показаны для α-спирали остатков 92–110; расстояния N···O = 2.70–2.93 Å, паттерн i→i−4 подтверждает α-спиральную конформацию.
Водородные связи боковых цепей — обнаружены в активном центре; субстрат (GLC) образует 7 H-связей с Asp58, Lys163, Arg130, His164, Tyr210, Ser370 и каталитическим Glu458.
Солевые мостики — обнаружены (64 уникальных пары), минимальное расстояние 2.49 Å; большое число солевых мостиков соответствует термостабильности белка из T. neapolitana.
Дисульфидные связи — не обнаружены; все 4 цистеина (Cys128, Cys161, Cys218, Cys296) свободны; минимальное d(Sγ···Sγ) = 13.48 Å.
Стекинг-взаимодействия — обнаружены 14 пар; наиболее выраженный параллельный стекинг — Tyr403/Phe432 (d = 3.78 Å, угол 5.3°); T-образный стекинг — Phe469/Tyr470 (d = 4.98 Å, угол 83.2°).