Структура/функция. Поиск по структуре

Введение

Мой Uniprot ID: A0A6Q2YM18.
Этому идентификатору соответствует белок с названием: субъединица 1 рецептора гамма-аминомасляной кислоты типа B из организма Esox lucius (щука обыкновенная).
Чтобы разобраться в механизме работы этого рецептора и его устройстве я решил поискать какую-нибудь не очень старую статью. В итоге мне удалось ее найти: doi: 10.3390/molecules25133093. Журнал средненький (impact factor 4.4), зато статья 2020 года и содержит в себе упоминания основных структурных особенностей, связанных с рецепторной функцией, устройством полноценной структуры рецептора, аллостерической регуляцией, которые я опишу ниже.
GABAB-R является гетеродимером, который состоит из двух субъединиц: B1 (которая является целью этого задания) и B2. Каждая субъединица состоит из внеклеточного домена (VFT), трансмембранного домена, состоящего из 7 спиралей, и линкера между ними (рис. 1). При изучении РСА структуры VFT было отмечено что B1 субъединица имеет сайт связывания (ортостерический), а для B2 не было показано взаимодействие с лигандами. Однако для B2 субъединицы указано основное участие в рекрутировании G-белка (взаимодействие через его 7TM субъединицу) и наличие аллостерического сайта связывания.

Рис 1. Схематическая репрезентация GABAB-R, взятая из представленной выше статьи. VFT - внеклеточный домен, 7TM - трансмембранный домен и линкер, который взаимодействует с внеклеточной петлей (ECL2) 7TM
Было также показано, что связывание рецептором агонистов связано с закрытой/активной конформацией VFT участка B1 субъединицы, а взаимодействие с антагонистами - с открытой/неактивной. Формирование гетеродимера VFT происходит за счет нековалентных взаимодействий между этими доменами двух субъединиц.
Для трансмембранных доменов также показаны взаимодействия между субъединицами. В неактивном сотоянии наблюдаются взаимодействия между спралями TM3 (GABAB1) – TM5 (GABAB2) и TM5 (GABAB1) – TM3 (GABAB2). При активации рецептора происходит ротация доменов, из-за чего начинают взаимодействовать уже спирали TM6 каждой субъединицы.
Как уже было сказано выше сайт связывания агонистов и антагонистов находится в субъединице B1. Этот сайт образуется аминокислотами из двух долей субъединицы B1 (называются они LB1 и LB2). Аминокислоты, которые располагаются в LB1 участвуют в связывании как антагонистов, так и агонистов, при этом взаимодействия с остатками для них обоих очень схожи. 2 аминокислоты, образующие сайт связывания (Trp, Tyr) находятся в LB2. При этом для них выделяют различные взаимодествия остатков с агонистами и антагонистами.
Остальные особенности устройства рецептора в большей мере связаны с B2 субъединицей, поэтому ее функции пока не будем затрагивать, если, конечно, при выполнении задания эти знания не понадобятся.
Таким образом из литературы можно сделать следующие выводы о влиянии мутаций на этот рецептор. При замене аминокислоты в структуре рецептора может произойти:
1. Может нарушиться целостность как самой субъединицы, так и гетеродимера.
2. Может нарушиться функция связывания субстрата (здесь мне немного повезло, т.к. выше был упомянут тот факт, что антагонисты и агонисты связываются одинаковым набором аминокислот, поэтому можно будет рассмотреть хотя бы одну структуру с любым лигандом).
3. Может нарушиться локализация или стабильность рецептора при нахождении в липидной оболочке (при появлении в 7TM полярных аминокислот, направленных в толщу фосфолипидного бислоя).
После сбора информации о самом рецепторе был запущен белковый бласт против PDB.
Всего нашлось 28 записей. Все они относятся либо к человеку, либо к дрозофиле. 6 лучших находок (рис. 2.) имеют процент идентичности больше 74% (наибольшее значение 80%) при этом покрытие больше 73% (наибольшее значение 90%). В принципе это не очень удивительно, ведь человек и щука не самые близкие родственники. Остальные находки имели либо большие значения покрытия и маленькие значения идентичности (их мне сложно объяснить), а остальные имели маленькие значения покрытия и различные значения идентичности от 28% до 80% (это связано по-видимому с тем, что есть структуры лишь отдельных доменов субъединицы из-за чего и появлялись находки с маленьким покрытием, но хорошим значением идентичности).

Дерево выбранных организмов — Рис. 2. Выдача blastp с параметрами по умолчанию против PDB DB.

На первых парах я решил остановиться на структуре 7C7S из организма Homo sapiens. Выбрал я ее из-за 90% покрытия (лучшее из всех), хоть и с 75% идентичностью, что не удивительно (см. выше). Более того эта структура содержит в себе обе субъединицы, что выжно для рассмотрения случаев замены аминокислот в участках их взаимодействия, и субстрат-антагонист CGP54626 (рис. 3). Глюкопираноза, которая также указана в списке лигандов по-видимому не является субстратом рецептора (т.к. облепляют структуру рецептора снаружи и не находится в кармане связывания) (рис. 4).
Стоит отметить, что субстрат имеет полную структуру.

Нумерация в 7C7S отличается от нумерации в Uniprot на +4.

Первая мутация

Первая мутация: W392H, которая в структуре pdb будет иметь номер 392 + 4 - 1 (-1 из-за одного гэппа, появившегося в последовательности PDB после выравнивания с последовательностью из Uniprot) = 395.
Обе аминокислоты имеют ароматичные кольца. Оба радикала способны образовывать водородные связи.
Триптофан 395 не входит с окружающими его аминокислотами ни в какие взаимодействия. Сначала у меня было предположение, что Trp395 образует пи-стэкинг с Tyr396, однако при расстояние между их кольцами слишком велико (да и по геометрии, кажется, что тирозин не достаточно повернут в сторону триптофана). С Tyr367 аналогичная ситуация. Таким образом можно сделать вывод, что Trp395 не участвует в поддержании третичной структуры и фолда в целом (рис. 5).

Trp395 скорее всего вступает в стэкинг взаимодействие с ароматичным кольцом субстрата (рис. 6). Расстояние и геометрия в пределах допустимого, хотя и не идеальные. Таким образом можно предположить, что такое взаимодейстие не вносит глобального влияния на связывание субстрата.

Проведен мутагенез. При этом выбран ротамер с наименьшим стрэйном = 12,55.
Мутантаный гистидин также не образует новых водородных связей с окружением. Помимо этого из-за сильного отдаления от ароматичного кольца субстрата теряется стэкинг взаимодействие (рис. 7).

Так как фолд самой структуры при такой замене не изменился, значит другие взаимодействие рецептора с субстратом не изменились (рис. 8). Сохранились 3 водородные связи, которые скорее всего несут основную роль в связывании субстрата.
Таким образом я бы сделал вывод, что данная мутация имеет слабо негативный эффект на связывание субстрата.

Вторая мутация

Вторая мутация: S267R. В структуре pdb серин будет иметь номер 267 + 4 - 1 (аналогично первой мутации) = 270.

Обе аминокислот имеют гидрофильный радикал. Способны к образованию водородных связей. Аргинин положительно заряжен и потому может участвовать в образовании солевых мостиков. Аргинин имеет куда более длинный радикал по сравнению с серином.

Серин 270 оказался довольно интересным для рассмотрения. При рассмотрении первой мутации я забыл упомянуть про водородную связь не только между остовом серина 270, но и его радикала с субстратом (расстояние здесь хорошее, а геометрия на грани, хотя для серина мы отмечали возможность образования водородных связей даже при угле 90 градусов) (рис. 9).

При замене серина на аргинин (после мутации выбран ротамер с самым маленьким стрэйном = 21.86 и проведен скалптинг) структура почти не изменилась, как и положение субстрата в кармане связывания (рис. 10)(произошел только поворот вокруг 1-ой связи из-за чего развернулось неароматичное кольцо субстрата). Поэтому осталась почти без изменений водородная связь между остовом Arg 270 (рис. 11).

Однако теперь утрачена водородная связь с боковым радикалом, при этом новых взаимодействий боковой радикал Arg не образует.

Таким образом получается, что такая мутация не вносит изменений в третичную структуру рецептора и его фолд, основное количество взаимодействий (3 из 4 водородных и стэкинг) сохраняются. Получается, что подобная замена может привести к увеличению энергии связывания субстрата, что может привести к уменьшению специфичности, афинности рецептора. Я бы сказал, что данная мутация несет негативный эффект.

Третья мутация

Третья мутация: M426K. Метионин в структуре PDB будет иметь номер 426 + 4 - 1 = 429.
Аминокислоты разные по химическим свойствам. Лизин может образовывать водородные связи, его радикал гидрофильный.
Метионин в данном случае скорее всего выполняет роль заполнения пространства. При этом вокруг него довольно много гидрофобных аминокисотных радикалов, с которыми он вероятно имеет гидрофобные взаимодействия. Возможно эти взаимодействия могут влиять и на связывание субстрата.

При проведении мутации из 20 ротамеров самые маленькие значения стрэйна были у 2 (рис. 13, 14).

Оба ротамера имеют маленький стрэйн, однако, ротамер 1 не внесет никакого изменения ни в структуру, ни в связывание субстрата, так как не образует никаких новых взаимодействий.
Ротамер 2 выглядит куда интереснее, так как он может образовать водородную связь с Glu466, который в свою очередь уже взаимодействует с субстратом.
Однако после проведения скалптинга, получилось, что Glu466 отдалилась от субстрата (рис. 15).
Однако, если принять, что водородные связи могут иметь рассотяние до 3.5 Å, то в таком случае водородная связь останется.

Таким образом ответ здесь может отличаться от того, какой же все-таки ротомер действительно был бы в структуре после мутации. Но в любом случае такая мутация либо не имеет никакого влияния (в обоих случаех), либо имеет очень слабый негативный эффект при ротамере 2.