Мембранные белки. Занятие 8.

Задание 0. поиск по бд. OPM или PDBTM.

PDB код	Тип (спираль, баррель)	Какая мембрана (внутренняя или внешняя, организм, органелла)	Толщина гидрофобной части мембраны в ангстремах	Медиана числа остатков в одном трансмембранном участке
1bxw	бета-бочка	внешняя клеточная мембрана грамм-отрицательных бактерий; E.Coli	25.4 ± 1.9	9.5
3b07	бета-бочка	секретируемый (патогенный белок для гемолизиса атакуемых клеток); Staphylococcus aureus	21.4 ± 1.0	6.5
1p4t	бета-бочка	внешняя клеточная мембрана грамм-отрицательных бактерий; Neisseria meningitidis	24.9 ± 2.4	11
3beh	Спиральный белок	Внутренняя клеточная мембрана грамм-отрицательных бактерий; Rhizobium loti	30.6 ± 0.8	20
1vry	Спиральный белок	плазмолемма эукариот; Homo sapiens	23.2 ± 3.7	17
3rlb	Спиральный белок	Плазмолемма грамм-положительных бактерий; Lactococcus lactis	30.8 ± 1.8	19

Данные, приведенные в таблице взяты из OPM и TCDB.
Среднее число остатков в одном трансмембранном участке посчитано по доступным данным: числу вторичных трансмембранных структур и соответствующим номерам остатков (OPM).

Целью данного задания было научиться пользоваться базами данных о мембранных белках. Функция последнего белка оказался для меня интересной. Узнать больше об этом белке активного транспорта тиамина (витамина В1) оказалось возможным на TCDB.

Задание 1. отбор гомологов.

Приступим к рассмотрению гомологов белка 2FYN (Q02761 ; CYB_RHOSH ; Cytochrome b), принадлежащего организму Rhodobacter Sphaeroides из филума Proteobacteria. Для этого прямо на сайте Blast исключим весь филум, чтобы получить достаточно удаленные гомологи.
Выдача Blast составляла 500 организмов, параметры для первого и последнего привожу ниже, чтобы показать достоверность гомологов:


Max score	Total score	Query cover	E value		Max ident	Accession

420		 420		88%		4e-145		53%		P48875.1
347	 	 347		90%		8e-117		49%		Q956Z6.1

Повторю еще раз, что все эти белки нам подходят, так как еще при формировании запроса были исключены близкородственные организмы, а также "модели" и "среды" (океан, кишечник и т.д.).

Теперь, выбрав все и проследовав по ссылке GenPept, нажимаем справа в окошке на "Tree" и отбираем любые организмы по нашему усмотрению из разных таксономических групп (Рис. 1).
В итоге получается 20 белков: 15 по каждой выделенной на Рис.1 таксономической группе плюс 5 белков из самой представленной - плацентарных.

Phytophthora megasperma
Dictyostelium discoideum
Chondrus crispus
Marchantia polymorpha
Oryza sativa Japonica Group
Zancudomyces culisetae
Rhizopus oryzae
Allomyces macrogynus
Ustilago maydis 521
Vanderwaltozyma polyspora DSM 70294
Trichoplax adhaerens
Metridium senile
Corvus brachyrhynchos
Zaglossus bruijni
Acipenser persicus
Marmota broweri
Rhinophylla fischerae
Sorex excelsus
Mustela altaica
Microcebus murinus

Q35522.1
Q37311.1
P48875.1
P26852.2
P0C524.1
Q3T4C8.1
Q3T4F1.1
Q37395.1
Q0H8X3.1
A6H4Q4.1
Q1AGX7.1
O47499.1
Q950C7.1
Q5ZN98.1
Q9G3M2.1
Q9TH46.1
Q9GAM7.1
O79997.2
Q9GBG9.1
Q9G0S9.1

Рис. 1

Задание 2. Анализ структуры выданного белка.

Белок 2FYN в базе ОРМ лежит под именем 2qjy.
Опишем его по приведенному образцу.

PDB ID	Организм	Тип мембраны	TC-код	Наклон спиралей (бета-тяжей) к нормали	Количество трансмембранных спиралей (бета-тяжей в бочонке)	Название белка
2qjy, 2fyn, 2qjk, 2qjp	Rhodobacter sphaeroides (из цианобактерий)	внутренняя мембрана грамм-отрицательных бактерий	3.D.3	0 ± 0 (в среднем, за счет симметрии; наклон цепей составляет 6, 9 и 34 градуса)	20	Бактериальный цитохром bc1 (Cytochrome bc1, bacterial)

ТС-код в базе данных ОРМ, относящийся к структуре данного, ссылается только на надсемейство:
3.D.3 The Proton-translocating Quinol:Cytochrome c Reductase (QCR) Superfamily (семейство цитохром с редуктаз, хинол-протонных переносчиков).
3.D: Oxidoreduction-driven transporters (переносчики, приводимые в действие окислитено-восстановительными реакциями).
3 Primary Active Transporters (первично активируемые переносчики)

В то же самое время на SRS для того же самого вида и ID белка находится другая ссылка: TCDB; 3.E.2.1.1.
Проверка показала, что по указанной ссылке, действительно, лежит заданный белок, значит, именно ее мы и выбираем.
В общем случае ТС-код расшифровывается так:

V.W.X.Y.Z.
V (число) соответствует классу транспортера (то есть, канал, переносчик, работающий отдельно или связанный в цепь)
W (БУКВА) соответствует подклассу транспортера, который в случае первичных активных переносчиков относится к источнику энергии, используемому для управления транспортом
X (число) соответствует семейству транспортера (иногда на самом деле надсемейства)
Y (число) соответствует подсемейству
Z соответствует субстрату или набору транспортируемых субстратов

В случае же выбранного белка - так:

3 Primary Active Transporters (первично активируемые переносчики)
3.Е Light absorption-driven transporters (светопоглощающие переносчики)
3.E.2: The Photosynthetic Reaction Center (PRC) Family (семейство белков реакционного центра фотосинтеза)
3.E.2.1.1 переносчики протонов (за счет световой энергии)

Задание 3. Анализ множественного выравнивания трансмембранных белков.

С использованием полученных ранее гомологов и самого белка был составлен файл с последовательностями.
В Julview сделано выравнивание muscle with defaults, после чего белку была сопоставлена его структура в PDB.
Файл, к сожалению, оказался из 3 повторяющихся ячеек кристалла, так что было очень неудобно работать с большим, неповоротливым файлом. Также не приходится надеяться на очень красивые картинки, но уж такой файл был дан.

По структуре PDB на новой строке аннотаций были выделены области ТМ спиралей.
По гомологу Q35522 программой TMHMM тоже были предсказаны ТМ спирали, отмеченные таким же образом на новой строке. Часть этих результатов можно видеть на Рис. 2.

no picture

Рис. 2

После этого структура была повернута р-стороной вниз и раскрашена по гидрофобности (стандарт: A, L, I, V, M, F - красные, N, R, K, P, Q, S, Y - синие) с консервативностью 26.
В результате картинка (Рис.3) показывает, что самые неконсервативные участки лежат вне мембраны - это 2 короткие петли со спиралями. Самые консервативные участки же лежат на границе гидрофобности/гидрофильности в глубине белка, ближе всего к каналу.
ТМ спирали обладают различным уровнем консервативности, в целом средним (Рис. 2). Можно заметить, что есть очень консервативные остатки как в спиралях, так и вне их. То же самое относится и к неконсервативным областям.
no picture

Рис. 3

Как и ожидалось, в ТМ-спиралях преобладают гидрофобные аминокислоты: аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, глицин, не редки фенилаланин и даже триптофан.
Однако встречаются довольно часто и аргинин, лизин, кислоты и пролин. В этом случае часто лизин оказывается на границе спирали, вылезая заряженной частью из мембраны.

Как уже говорилось ранее, внемембранные участки включают в себя и самые консервативные, и самые вариабельные участки. Зависимость здесь больше коррелирует с близостью к каналу и активному центру белка.

Все спирали этого белка разделились на 2 типа: те, где заряженных остатков почти нет, и те, где их много, они консервативны, а положительный и отрицательный заряды чередуются с хорошей периодичностью. Это говорит о том, что спирали в белке разделились на те, что удерживаются в мембране благодаря своей гидрофобности, и те, которые уже образовали все водородные связи, и больше сделать этого просто не могут.
Общую картину можно отследить на Рис.4.

no picture

Рис. 4

На этом же рисунке можно увидеть, что программа TMHMM предсказала 2 лишние ТМ спирали. По PDB файлу видно, что на самом деле это околомембранные небольшие спирали, частично погруженные в мембрану. Одна из них достаточно сильно некодсервативна, о чем свидетельствует самый большой геп последовательности, пришедшийся как раз на эту спираль. Другая наоборот располагается в самом консервативном участке выравнивания и лежит в глубине белка.

Дополнительно.

Возьмем средний размер клетки за 8 мкм, что в 2000 раз больше толщины мембраны.
Дыню будем брать большую, так вкуснее - 30 см =)
получается мембрана в 150 мкм, это в 3 раза больше толщины волоса.

На страницу 4 семестра