Сравнение матриц аминокислотных замен

Матрица весов аминокислотных замен – это симметричная таблица, в которой по вертикали и по горизонтали в одинаковом порядке расположены названия аминокислот. В местах пересечения столбцов и строчек, соответствующих определенным аминокислотам располагаются числа – веса аминокислотных замен. Они дают относительную оценку заменам аминокислот, исходя из частот встречаемости этих замен в природе. Матрицы типа BLOSUM построены с использованием базы данных BLOKS, в ней содержатся множественные сопоставления отдельных участков (блоков) белков из различных семейств. При построении матриц учитывается частота встречаемости различных замен аминокислот, а также и то, что эти частоты могут значительно сдвигаться из-за наличия почти идентичных последовательностей в BLOKS. Для того, чтобы избежать сдвига, похожие последовательности кластеризуют (группируют в кластер), а веса замен в кластере считают относительно его величины. Для определения «схожести» последовательностей вводят число – порог идентичности. Если процент идентичности выравнивания двух последовательностей больше, чем порог идентичности, то они группируются в кластер. Причем для попадания в кластер последовательности нужно преодолеть этот порог в сравнении хотя бы с одной последовательностью из кластера. Таким образом, в кластере могут оказаться и последовательности со значением идентичности много меньше, чем порог. Не для любых белков можно применять матрицу BLOSUM, так как в базе данных BLOKS собраны в основном последовательности цитоплазматических белков. Если белок локализован в мембране, то веса замен аминокислот могут существенно отличаться. Поэтому для таких белков созданы специальные матрицы, например матрица PHAT. В этих матрицах частота встречаемости замен описывается, основываясь на выравниваниях трансмембранных участков белков. В ходе выполнения задания матрица BLOSUM62 была реконструирована с использованием последней весрии базы данных BLOKS. Далее эта матрица будет обозначаться BLOSUM62*.
Матрица BLOSUM62*

Таблица 1. Сравнение весов замен для изолейцина в различных матрицах

Трехбуквенное обозначение аминокислоты	Однобуквенное обозначение аминокислоты	Вес по матрице BLOSUM62	Вес по матрице PHAT	Вес по матрице BLOSUM62*
Ile	I	5	4	4
Leu	L	2	2	2
Val	V	3	3	2
Ala	A	-1	0	-2
Gly	G	-4	-2	-4
Arg	R	-3	-6	-3
His	H	-3	-5	-3

Замена аминокислоты Ile на саму себя

Величины замены аминокислоты Ile на саму себя для матриц BLOSUM62 – 4, а для матрицы PHAT – 5. Эти значения отличаются, так как матрицы BLOSUM применяются для цитоплазматических белков, а PHAT для трансмембранных участков. Мембранные белки должны обладать достаточно консервативным расположением гидрофобных аминокислот в своей структуре для заякоривания в мембране. Поэтому гидрофобные аминокислоты в мембранных белках изменяться будут реже, а встречаться друг против друга в выравниваниях чаще. Это приводит к увеличению значения веса их замен на самих себя в матрице PHAT.

Замена аминокислоты Ile на близкие по химическим свойствам

Изолейцин - алифатическая гидрофобная аминокислота. Также к этой группе относятся лейцин, валин и аланин. В таблице 1 приведены значения весов замен Ile на эти аминокислоты. Как видно из таблицы, вес по матрице PHAT всегда больше или равен весам по матрицам BLOSUM, а веса по матрицам BLOSUM одинаковые (за исключением Ala, возможно это связано со статистическими факторами, так как в матрице BLOSUM62* использована более новая версия BLOKS). Эти результаты можно объяснить так же, как и в случае замены аминокислоты Ile на саму себя. Замена гидрофобной аминокислоты на гидрофобную в мембранном белке будет встречаться немного чаще, чем в цитоплазматическом.

Замена аминокислоты Ile на аминокислоты из других функциональных групп

Как видно из таблицы 1, замена изолейцина на глицин в мембранных белках сохраняется в большем числе случаев, чем в цитоплазматических. Возможно, это связано с тем, что глицин не является заряженной аминокислотой и может беспрепятственно находится в мембране. В случае трансмемранных белков - это преимущество. Однако для цитоплазматических белков такого преимущества у глицина нет, и его сохранение менее благоприятно. Необходимо отметить, что во всех трех случаях подобная замена сохраняется дочтаточно редко - все веса замен отрицательные.

Для аргинина и гистидина наблюдается обратная картина. Эти аминокислоты положительно заряженные, и частота замены изолейцина на них в мембранных белках меньше, чем в цитоплазматических. Положительно заряженная аминокислота будет препятствовать нахождению белка в мембране, а значит, он перестанет выполнять свою функцию. Все веса замен изолейцина на гистидин и аргинин большие по модулю и отрицательные, это означает, что такие замены встречаются крайне редко.

Сравнение выравниваний, полученных для коротких мутантов вручную и построенных классическими алгоритмами Нидлмана-Вунша и Смита-Ватермана

Краткое описание программ needle и water пакета EMBOSS

Программа needle реализует алгоритм Нидлмана-Вунша, предназначенный для глобального парного выравнивания. Глобальное выравнивание означает, что последовательности сравниваются друг с другом целиком, и если одна последовательность меньше другой, то она будет дополнена до размера большей с помощью gap. Программа water реализует алгоритм Смита-Ватермана, который выполняет локальное парное выравнивание. В случае локального выравнивания программа находит оптимальное по весу выравнивание на определенном участке последовательности. Вне этого участка, в отличие от программы needle, пробелы (gap) не учитываются. Таким образом, при выравнивании короткой и длинной последовательностей процент сходства в программе water будет больше. После выполнения алгоритма обе программы записывают в файл результат с самым оптимальным весом выравнивания.

Подробнее об этих программах можно узнать, пройдя по ссылкам:
EMBOSS: water
EMBOSS: needle

Основные параметры, используемые программами needle и water

Для параметров в квадратных скобках значения задаются без указания названия параметра, просто записываются по порядку или при запросе программы.

Параметр	Краткое описание
[-asequence] и [-bsequence]	USA сравниваемых последовательностей
[-outfile]	Имя файла с выравниванием, который программа создает после выполнения алгоритма
-gapopen	Штраф за открывающий gap. Значение по умолчанию 10.0
-gapextend	Штраф за каждый gap, следующий за открывающим. Значение по умолчанию 0.5
-datafile	Используемая матрица весов замен. По умолчанию BLOSUM62 для белков и DNAFULL для ДНК

В связи с тем, что программа needle выполняет глобальное выравнивание, для неё важны также следующие параметры:

-endweight	Штраф за gap на конце выравнивания. По умолчанию отключена
-endopen	Штраф за открывающий gap на конце выравнивания. По умолчанию 10.0
-endextend	Штраф за каждый gap, следующий за открывающим на конце. Значение по умолчанию 0.5

Сравнение выравниваний, полученных для коротких мутантов вручную и построенных классическими алгоритмами Нидлмана-Вунша и Смита-Ватермана

С помощью скрипта evolve_protein.pl были созданы 3 последовательности mut1, mut2, mut3, с вероятностью изменения остатка (модель "ошибки" ДНК-полимеразы) 0,6, 0,6 и 0,4 соответственно, и с вероятностью замены остатка в случае изменения данной позиции 0,6, 0,8 и 0,8 соответственно. Таким образом, в последовательности mut1 вероятность мутации такая же, как и в mut2 и выше, чем в mut3, однако в mut1 вероятность возникновения инсерции или замены ниже, чем в mut2. В mut3 вероятность мутации ниже, чем в mut1 и в mut2, а также там с меньшей вероятностью произойдет инсерция или замена. В JalView мной была настроена схема цветов отображения аминокислот. Согласно этой схеме гидрофобные аминокислоты Gly, Ala, Val, Leu, Ile покрашены оранжевым, серосодержащие аминокислоты Met, Cys – желтым, гидрофобные Phe, Tyr, Trp – серым, нейтральные Ser и Thr – розовым, нейтральные Asn, Gln – темно-зеленым, иминокислота Pro – белым, кислые Asp, Glu – светло-зеленым, основные His, Lys, Arg – фиолетовым. Далее 3 последовательности mut1, mut2, mut3 в формате fasta были по очереди вручную выровнены с исходной последовательностью.

Сравнение выравниваний, полученных с помощью ручного выравнивания и программ water и needle для mut1

Таблица 1. Сравнение выравниваний для mut1.

-	Изображение участка выравнивания	identity	similarity	Вес	Положение выравнивания относительно длинной последовательности
Выравнивание, сделанное вручную		30%	40%	19.0	67-86
Выравнивание, полученное с помощью программы water		44.4%	77.8%	22.0	78-86
Выравнивание, полученное с помощью программы needle		2.9%	3.8%	21.0	74-86

На таблице 1 показано сравнение выравниваний, полученных с помощью ручного выравнивания и программ water и needle для mut1. Участок выравнивания с 79ой по 86ю аминокислоты совпадает во всех трех случаях. Вес выравнивания различается незначительно, однако identity и similarity различны. Выравнивание, полученное с помощью программы water имеет значения identity и similarity большие, чем выравнивание, полученное вручную. Это объясняется тем, что программа water выполняет локальное выравниваение. В данном случае оно построено не для кусочка в 20 аминокислот, как для ручного выравнивания, а для кусочка в 8 аминокислот, и так как значения identity и similarity вычиляются относительно размера последовательности, они отличаются для выравниваний разной длины. Значения identity и similarity для выравнивания, полученного с помощью программы needle значительно меньше, потому что программа needle осуществляет глобальное выравнивание, и эти значения вычисляются относительно полной длины последовательности.

Сравнение выравниваний, полученных с помощью ручного выравнивания и программ water и needle для mut2

Таблица 2. Сравнение выравниваний для mut2.

-	Изображение участка выравнивания	identity	similarity	Вес	Положение выравнивания относительно длинной последовательности
Выравнивание, сделанное вручную		25%	30%	9.0	176-195
Выравнивание, полученное с помощью программы water		35.3%	41.2%	23.0	31-40
Выравнивание, полученное с помощью программы needle		2.5%	2.9%	15.0	30-42

На таблице 2 показано сравнение выравниваний, полученных с помощью ручного выравнивания и программ water и needle для mut2. Для значений identity и similarity наблюдается такая же картина, как и в случае mut1. Однако участки выравнивания не совпадают. Можно сделать вывод, что ручное выравнивание было сделано неправильно, так как участки выравниваний, полученных программами needle и water совпадают, и их вес заметно больше, чем в случае ручного выравнивания.

Сравнение выравниваний, полученных с помощью ручного выравнивания и программ water и needle для mut3

Таблица 3. Сравнение выравниваний для mut3.

-	Изображение участка выравнивания	identity	similarity	Вес	Положение выравнивания относительно длинной последовательности
Выравнивание, сделанное вручную		50%	55%	39.0	174-193
Выравнивание, полученное с помощью программы water		60%	70%	50.5	174-193
Выравнивание, полученное с помощью программы needle		5.6%	6.9%	48.5	174-196

На таблице 3 показано сравнение выравниваний, полученных с помощью ручного выравнивания и программ water и needle для mut3. Для значений identity и similarity наблюдается такая же картина, как и в случаях mut1 и mut2, но в этом случае участки выравнивания совпадают. Различия веса и значений identity и similarity для ручного выравнивания и полученного с помощью water различаются из-за того, что программа water смоделировала делецию 185й и 186й аминокислот исходного пептида, и не стала включать в выравнивание последние две аминокислоты mut3. В этом случае постановка gap оказалась целесообразной, что было не очевидно в ручном выравнивании. Значения identity и similarity для выравнивания посредством needle ниже, чем в двух других случаях. Это согласуется с результатами для mut1 и mut2. Зато вес в третьем случае лишь ненамного ниже, чем во втором. Небольшое уменьшение наблюдается из-за постановки gap, которая не до конца компенсируется весом совпадения лизина 195. Такое различие в значениях identity, similarity и в весе выравниваний, полученных с помощью программ needle и water наглядно иллюстрирует различия локального и глобального выравниваний.