Историю запросов и результатов PubMed
| Запрос | Запрос как его понял PubMed из Search details | Всего находок | Всего в открытом доступе | Всего обзоров |
| ("14-3-3 sigma"[Title]) OR 14-3-3σ[Title] | "14-3-3 sigma"[Title] OR 14-3-3sigma[Title] | 186 | 97 | 5 |
| (("14-3-3 sigma"[Title]) OR 14-3-3σ[Title]) AND interacts[Title/Abstract] | ("14-3-3 sigma"[Title] OR 14-3-3sigma[Title]) AND interacts[Title/Abstract] | 5 | 4 | 0 |
| ((14-3-3sigma[Title] OR 14-3-3 sigma[Title/Abstract]) AND cell cycle[Text Word]) AND pathway[Title/Abstract] | ((14-3-3sigma[Title] OR 14-3-3 sigma[Title/Abstract]) AND cell cycle[Text Word]) AND pathway[Title/Abstract] | 12 | 6 | 1 |
| (((14-3-3σ[Title]) OR 14-3-3 sigma[Title]) AND regulation[Title/Abstract]) AND pathway[Title/Abstract] | ((14-3-3sigma[Title] OR 14-3-3 sigma[Title]) AND regulation[Title/Abstract]) AND pathway[Title/Abstract] | 7 | 2 | 2 |
| ((14-3-3σ[Title]) OR 14-3-3 sigma[Title]) AND function[Title/Abstract] | (14-3-3sigma[Title] OR 14-3-3 sigma[Title]) AND function[Title/Abstract] | 31 | 22 | 1 |
| ((14-3-3 sigma[Title]) OR 14-3-3σ[Title]) AND pathway[Title/Abstract] | (14-3-3sigma[Title] OR 14-3-3 sigma[Title]) AND pathway[Title/Abstract] | 17 | 9 | 2 |
| (((14-3-3 sigma[Title]) OR 14-3-3σ[Title]) AND pathway[Title/Abstract]) AND ("2011"[Date - Publication] : "3000"[Date - Publication]) | ((14-3-3 sigma[Title] OR 14-3-3sigma[Title]) AND pathway[Title/Abstract]) AND ("2011"[PDAT] : "3000"[PDAT]) | 4 | 1 | 0 |
Персональная коллекция публикаций о белке 14-3-3sigma
В результате поиска публикаций о белке 14-3-3sigma в Pubmed мной создана коллекция наиболее подходящих к заданной теме статей. Ссылка на неё представлена ниже:
Коллекция публикаций о белке 14-3-3sigma
Немного о семействе белков 14-3-3
14-3-3 - это семейство консервативных молекул, которые экспрессируются в клетках эукариот. Их особенность заключается в том, что они могут присоединяться к множеству различных регуляторных молекул, например к различным киназам, фосфатазам, трансмембранным рецепторам. Белки из семейства 14-3-3 участвуют во многих регуляторных процессах, например в процессах регуляции клеточного цикла и в апоптозе.[3]
Регуляция и функция белка 14-3-3 σ
Рис.1. Регуляция и функция белка 14-3-3 σ. Пояснения в тексте. Источник картинки: "The role of epigenetic inactivation of 14-3-3sigma in human cancer"
Регуляция и функция белка 14-3-3 σ схематически представлены на рисунке 1. После повреждения ДНК p53 присединяется к промотору гена 14-3-3 σ и вызывает его транскрипцию. BRCA1 выступает в качестве ко-активатора этого процесса. В цитоплазме 14-3-3 σ формирует гомодимеры, которые присоединяются к различным лигандам, фосфорилированным по остаткам серина и треонина в связывающем участке. Транспорт комплексов циклин B/CDC2 в ядро необходим для начала митоза. 14-3-3 σ не дает этим комплексам проникнуть в ядро, соединяясь с ними. Содержащий BH3 домен BAD (Bcl-2-associated death promoter protein), фосфорилированный протеинкиназой В, связывается с 14-3-3 σ и теряет возможность противостоять анти-апоптической функции BCL2-побобных белков. Таким образом, экспрессия 14-3-3 σ предотвращает апоптоз клеток. Доминантная отрицательная форма белка p63 подавляет экспрессию 14-3-3 σ. Метилирование гена 14-3-3 σ по CpG сайтам вызывает его эпигенетический сайленсинг. Убиквитинлигаза присоединяет к 14-3-3 σ убиквитин, что приводит к расщеплению 14-3-3 σ протеасомой. [1]
Краткое описание эксперементальной статьи
В этом разделе представлено описание эксперементальной статьи, объектом исследования которой является белок 14-3-3 σ. Источник всех изображений этого раздела - описываемая статья. Ссылка на неё представлена ниже.[2]
J Biol Chem. 2000 Jul 28;275(30):23106-12.
Association of the cyclin-dependent kinases and 14-3-3 sigma negatively regulates cell cycle progression.
Laronga C, Yang HY, Neal C, Lee MH.
Source
Departments of Surgical Oncology/Molecular and Cellular Oncology and the Breast Cancer Research Program, the University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030, USA.
PMID: 10767298
Связь циклин-зависимых киназ (CDK) с белком 14-3-3 σ тормозит прохождение клеткой стадий клеточного цикла
Аннотация
Белок 14-3-3 σ был клонирован с помощью экспрессионного клонирования (expression cloning). Было выяснено, что 14-3-3 σ содержит CDK2-связывающую последовательность, такую же, какая встречается у белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, например p21, p27. Также было выяснено, что 14-3-3 σ связывается с циклин-CDK комплексами in vitro и in vivo. И что повышенная выработка клеткой 14-3-3 σ затрудняет прохождение клеточного цикла, посредством ингибирования им активности циклин-CDK комплекса во многих линиях клеток рака молочной железы. Это затрудняет пролиферацию и рост клеток. Данные открытия показали, что 14-3-3 σ отрицательно регулирует протекание клеточного цикла, и что он играет важную роль в предотвращении роста клеток опухоли молочной железы.
Результаты
Мышиный ген 14-3-3 σ был определен с помощью метода экспрессионного клонирования в результате поиска белков, связывающихся с CDK2.
Экспрессинонное клонирование кДНК 14-3-3 σ
ПЦР-сгенерированные с помощью рестриктаз NdeI и BamHI фрагменты человеческой CDK2 кДНК, содержащие кодирующий участок целиком были клонированы в векторе pET21a. Таким образом, была получена структура, которая кодирует CDK2 с FLAG-эпитопом. Рекомбинантный FLAG-CDK2 был фосфорилирован радиоактивным АТФ in vitro протеинкиназой А. Фосфорилированный CDK2 был использован для исследования библиотеки кДНК 16-ти дневных мышиных эмбрионов. По меньшей мере 10 миллионов клонов было обследовано, некоторые из них были секвенированы, и один из них содержал полноразмерную кДНК с мышиным геном, кодирующим белок 14-3-3 σ.
В результате поиска в GenBank™ выяснилось, что человеческий и мышиный 14-3-3 σ родственны друг другу (96% сходства). Анализ последовательности 14-3-3 σ выявил его важную особенность – наличие богатого лейцином участка (NES), который отвечает за экспорт протеина из ядра в цитоплазму через ядерные поры. После того, как мышиный 14-3-3 σ был определен с помощью экспрессионного клонирования с CDK2 в качестве «приманки», его предполагаемую циклин-CDK связывающую последовательность сравнили с циклин-CDK связывающими последовательностями белков, которые играют важную роль в регуляции клеточного цикла, включая p27, p57, p21 и др. В результате сравнения было выявлено их высокое сходство. На основе этих данных был сделан вывод, что с помощью этой последовательности 14-3-3 σ может взаимодействовать с различными CDK.
Чтобы доказать, что 14-3-3 σ действительно связывается с циклин-CDK2 комплексом, рекомбинантый 14-3-3 σ, содержащий FLAG-эпитоп, был очищен с помощью ковалентно связанных с агарозой моноклональных антител к FLAG-эпитопу и использован для анализа in vitro. 14-3-3 σ, содержащий FLAG-эпитоп, был закреплен на агарозных шариках и обработан экстрактом из клеток насекомых, содержащим CDK2, CDK4, CDC2 и циклины A, B и D2. После обработки экстрактом получившуюся систему промыли и определили наличие 14-3-3 σ комплексов с добавленными протеинкиназами и циклинами с помощью антител к ним. Как показано на рисунке 2, 14-3-3 σ может присоединяться к CDK2, CDK4 и к комплексам циклин A/CDK2, циклин B/CDC2, циклин E/CDK2 и циклин D2/CDK4, а также к транслированным in vitro циклину Е и CDK2.
Рис.2. A-C. 14-3-3 σ связывается с CDK2, CDK4, CDC2, а также с различными циклин-CDK комплексами. D. 14-3-3 σ связывается с транслированными in vitro циклином Е и CDK2. Пояснение в тексте.
Для того чтобы проверить связывание 14-3-3 σ с CDK in vivo, одни клетки были заражены рекомбинантным аденовирусом, производящим много 14-3-3 σ, содержащего HA-эпитоп, а другие таким же вирусом, который производил β-галактозидазу. Затем клетки были иммунопреципинированы посредством CDC2 и CDK2 антител, разделены с помощью SDS-ПААГ электрофореза и обработаны антителами к HA-эпитопу. Как показано на рисунке 3, 14-3-3 σ связывается с CDC2 и CDK2.
Рис.3. Три линии клеток MSF7, HER-18 и 361 были обработаны вирусами, вырабатывающими β-галактозидазу (-) и 14-3-3 σ (+). Затем клетки обработали антителами на CDK2, CDC2. Как видно на рисунке, во взаимодействие с антителами вступили клетки, обработанные вирусом, который вырабатывал человеческий 14-3-3 σ.
Затем была изучена возможность связывания 14-3-3 σ с активными и неактивными формами CDK, и было показано, что 14-3-3 σ связывается с обеими. Эти данные доказывают, что 14-3-3 σ не блокирует активацию CDK, что отличает его от KIP1, который присоединяется к еще не активному комплексу циклин Е/CDK2, и предотвращает фосфорилирование Thr160, а значит и активацию CDK2.
Многие связанные с CDK белки могут положительно или отрицательно регулировать активность CDK. Чтобы изучить, может ли 14-3-3 σ регулировать активность CDK, посредством связи с ними, в различных клеточных линиях был увеличен уровень экспрессии 14-3-3 σ c помощью переноса генов вирусами. Рекомбинантный 14-3-3 σ аденовирус использовался для заражения клеток рака молочной железы, большинство клеток в популяции было инфецировано. CDC2 и CDK2 ингибируются белком 14-3-3 σ, как показал анализ активности киназ с помощью гистона H1. Гистон H1 используется как канонический субстрат для киназ в этом типе анализа, фосфорилирование H1 определяется с помощью SDS-ПААГ электрофореза, сопровождаемого авторадиографией. Ссылка на источник информации о методе анализа.
Все протестированные линии клеток были чувствительны к ингибиторной активности 14-3-3 σ вне зависимости от состояния p53, Rb и HER-2/neu (белков, которые участвуют в регуляции клеточного цикла посредством ингибирования CDK). Эти результаты говорят о том, что 14-3-3 σ непосредственно связывается с CDK и ингибирует его. Ингибиторная активность 14-3-3 σ наблюдалась и в неэпителиальных клетках, которые обычно не производят 14-3-3 σ.
Тот факт, что 14-3-3 σ ингибирует CDK, означает, что он отрицательно влияет и на пролиферацию клеток, останавливая прохождение стадий клеточного цикла. Чтобы подтвердить это, был использован MTT анализ и проточная цитометрия. MTT анализ – это метод, который основан на восстановлении МТТ цитоплазматическими дегидрогеназами. МТТ при восстановлении меняет цвет с желтого на пурпурный, а уровень его восстановления коррелирует с уровнем пролиферации клеток. Анализ клеточного цикла показал, что 14-3-3 σ действительно отрицательно влияет на прохождение клеточного цикла. Различные клеточные линии были вновь заражены рекомбинантным аденовирусом, производящим 14-3-3 σ. Спустя два дня после инфецирования, клетки были подвергнуты проточной цитометрии, и по состоянию их ДНК были определены стадии клеточных циклов, в которых находились клетки. Заражение клеток аденовирусом, производящим 14-3-3 σ, отрицательно повлияло на прохождение клетками стадий клеточного цикла, по сравнению с контролем, где клетки заражались вирусом, производящим β-галактозидазу.
Чтобы оценить влияние 14-3-3 σ на раковые клетки, две линии клеток MCF-7 и HER-18 были разделены на обработанные и необработанные аденовирусами, производящими β-галактозидазу или 14-3-3 σ. Клетки, обработанные аденовирусами, производящими β-галактозидазу, образовали примерно одинаковые по размеру колонии с необработанными вирусами клетками. Однако размер колоний клеток, обработанных аденовирусами, производящими 14-3-3 σ был намного меньше. В этом можно убедиться, посмотрев на рисунок 4.
Рис.4. Колонии клеток обработанных и необработанных аденовирусами, производящими β-галактозидазу или 14-3-3 σ. Пояснения в тексте.
Кроме того, было доказано, что 14-3-3 σ влияет на внутриклеточную локализацию CDK, он изолирует их из ядра в цитоплазму. А также то, что богатый лейцином участок (NES), действительно влияет на локализацию 14-3-3 σ, а также и на локализацию CDK. Последнее было доказано с помощью изучения взаимодействия антител к CDK с мутантными клетками (мутирование NES для нарушения его функции). В мутантных клетках окрашивалось ядро, а в клетках дикого типа цитоплазма.
Источники
1. The role of epigenetic inactivation of 14-3-3 in human cancer2. Association of the cyclin-dependent kinases and 14-3-3 sigma negatively regulates cell cycle progression.
3. 14-3-3 proteins: structure, function, and regulation