На главную страницу третьего семестра

Поиск сходных нуклеотидных последовательной, не кодирующих белки

1. Определение тРНК, использованной рибосомой при присоединении 4-ого аминокислотного остатка (изолейцина) к растущей цепи белка COAE_ECOLI

   Определил 4-й а/к остаток в белке COAE_ECOLI и соответствующий ему кодон в гене. По таблице стандартного генетического кода данной аминокислоте соответствует 3 кодона, то есть помимо кодона AUA 4-ю а/к моего белка могли бы кодировать также AUC и AUT. Далее через putty с помощью команды
   grep codon.*isoleucine ecoli.embl > codon.txt
   я нашел в файле генома ecoli.embl все упоминания о закодированных в нем изолейциновых тРНК. Затем требовалось только выбрать из списка подходящую строчку (с подходящей тРНК), найти полную информацию об этом гене через тектовый поиск и выделить через putty данную кодирующую нуклеотидную последовательность с помощью команды:
   seqret -sask1.
   При этом координаты требуемого участка вводились вручную, так же как и направление цепи - обратное (complement).
   Результаты приведены в таблице 1.

   
   Таблица 1. Выбор т-РНК  

   Аминокислотный остаток в 4-ой позиции белка COAE_ECOLI	I/Ile/Isoleucine
   Соответствующий кодон в гене coaE (возможная вырожденная позиция подчеркнута)	5'-AUA-3'
   Идеальный антикодон (возможная вырожденная позиция подчеркнута)	5'-UAU-3'
   Сколько можно было бы ожидать разных тРНК для остатка I, если опираться на генетический код?	3: AUA, AUC, AUT.
   Сколько разных тРНК для остатка I аннотировано в геноме кишечной палочки?	5 (среди них имеются все три возможные типа)
   Характеристика выбранной для дальнейшего изучения тРНК:
   имя гена	ileY
   локализация гена в геноме	2783784..2783859
   распознаваемый кодон	AUA;
   антикодон	CAU
   Результат поиска всех изолейциновых тРНК у Escherichia coli K-12: FT /note="codons recognized: AUY; anticodon: GAU isoleucine FT /note="codon recognized: AUA; anticodon: CAU; isoleucine FT /note="codon recognized: AUA; anticodon: CAU; isoleucine FT /note="codons recognized: AUY; anticodon: GAU isoleucine FT /note="codons recognized: AUY; anticodon: GAU isoleucine

2. Поиск гомологичных тРНК в родственном геноме

   Теперь мы попробуем с помощью четырех разных программ провести поиск гомологов полученной в первом пункте последовательности в геноме родственного к исходному организма Bacillus subtilis.
   Для действия программ нам необходимы индексные файлы по геному сенной палочки, содержащемся в документе bs_genome.fasta. Для этого используем команду:
   formatdb -i bs_genome.fasta -p F -n bs.
   Результаты работы приведены в таблице 2.

   
   Таблица 2. Поиск гомологичных кодирующих участков в геноме родственного организма различными программами.

   Программа	FASTA	BLASTN	MegaBLAST	discontiguous MegaBLAST
   Длина якоря	6	11	28	11
   Результаты поиска	В результате поиска мы получили наилучшую из всех программ находку по E-value и по длине выравнивания.	Результат поиска можно посмотреть здесь. На выходе получили 6 локальных выравниваний, правда с относительно высоким E-value даже у лучшей находки.	Программа ничего не обнаружила.	Выходной файл можно смотреть здесь. Он содержит 2 локальных выпавнивания. Причем лучшая находка здесь идентична лучшей находке в выходе с программы BLASTN.
   Число находок с E-value < 0,01	1	1	0	1
   Характеристика лучшей находки:
   E-value	1.6e-11	2e-04	-	3e-06
   длина выравнивания	77	36	-	36
   вес выравнивания	61 bits	40.1 bits	-	46.1
   координаты в геноме	11462..11538	158420..158455	-	158420..158455
   Аннотация лучшей находки по записи EMBL:
   имя гена	trnO-Ile	trnB-Met3	-	trnB-Met3
   это тРНК?	да	да	-	да
   это тоже изолейциновая тРНК?	да	нет, метиониновая	-	нет, метиониновая

   Команды, использовавшиеся непосредственно для проведения поиска:

   1. BLASTN
      blastall -p blastn -d bs -i I_tRNA.fasta -o bs_tRNA_out
   2. MegaBLAST
      megablast -d bs -i I_tRNA.fasta -o megablast_out -D 2 -e 10
   3. discontiguous MegaBLAST
      megablast -d bs -i I_tRNA.fasta -o dis_megablast_out -D 2 -e 10 -W 11 -t 16 -N 1
      Сначала при поиске я установил параметр t на максимум (=21), чтобы повысить чувсвительность поиска, но при этом у меня ничего не обнаружилось. То же самое было и с t=18. Наконец, при t=16 в файле выдачи оказались 2 находки.
   4. FASTA
      fasta34 I_tRNA.fasta bs_genome.fasta 6
      (при использовании также необходимо вручную указывать ряд опций).

   Подводя итоги необходимо отметить, что только программа FASTA в полной мере справилась с поставленной задачей, хоть ее вравнивание по качеству и не самое лучшее. Программы BLASTN и discontiguous MegaBLAST также обнаружили гомологичные тРНК, но не той аминокислоты. Вообще от них ожидались результаты получьше. Программа MegaBLAST не приспособлена для решения такого типа задач, которой от нее требовали, и мы убеждаемся в этом по результатам поиска.