Практикум 12

Часть I: подготовка чтений

Рис. 1.Анализ качества чтений

Как можно видеть на изображении, полученном с помощью программы FastQC для Windows, данные чтения имеют хорошее качество и приемлимую длину, поэтому не нуждаются в чистке.

1) Индексирование референсной последовательности:

/home/students/y06/anastaisha_w/hisat2-2.0.5/hisat2-build chr22.fasta chrbuild

2) Выравнивание прочтений и референса:

/home/students/y06/anastaisha_w/hisat2-2.0.5/hisat2 -x chrbuild -U chr22.1.fastq --no-softclip > align.sam

* В отличие от практикума 11, в этом коде нет параметра "--no-spliced-alignment", т.к. работа ведется с последовательностями РНК, прошедших сплайсинг и, возможно, имеющих разрывы.

3) Перевод выравнивания в бинарный код (.bam):

samtools view align.sam -bo align.bam

4) Сортировка выравнивания:

samtools sort align.bam -T temp.txt -o sort_align.bam

5) Индексирование отсортированного файла

samtools index sort_align.bam

6) Получение файла со статистикой:

samtools stats sort_align.bam > stats.txt

Согласно данным полученного файла, всего из 24294 прочтений картировались 23927; не картированными остались 367.

Часть II: подcчет чтений

1) Перевести файл с выравниванием из .bam формата в .bed формат:

/P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtobed -i sort_align.bam > sort_align.bed

2)Подсчет чтений:

bedtools intersect -a /P/y14/term3/block4/SNP/rnaseq_reads/gencode.genes.bed -b sort_align.bed -u > gene1.bed

Данная команда позволила мне узнать, какие гены покрывают данные чтения, через пересечения с общим файлом с разметкой генов. Опция -u позволила мне получить только те чтения, которые хотя бы раз пересекались с генами. При запуске без этого параметра полученный файл был гораздо больше и бессмысленней.

По результатам работы данной программы, большая часть чтений легла на ген белка PRAME (193). Небольшая часть легла на ген LL22NC03-63E9.3 (2), также кодирующий белок.