Известное изречение Феодосия Добжанского гласит: «Ничто в биологии не имеет смысла, кроме как в свете эволюции». В базе данных кристаллографических структур макромолекул PDB есть много примеров, наглядно это иллюстрирующих. Бывает, эволюционный процесс затрагивает тысячелетия - например, сравнивая последовательности гомологичных белков, мы можем составить подробные родословные родственных организмов. Изучая развитие устойчивости бактерий к лекарствам, мы можем видеть эволюцию, которая происходит за года, поскольку бактерии постоянно развивают новые методы уклонения от антибиотиков посредством мутаций и отбора их существующих систем.
Однако эволюция также может занимать всего несколько дней, что демонстрирует разбираемый нами ниже пример. Исследователи подвергли культуру ВИЧ-инфицированных клеток ингибитору протеазы ВИЧ и наблюдали, как все более устойчивые варианты протеазы эволюционировали в результате мутаций и отбора. Полученный в результате вариант отличается от исходного заменами по 6 позициям и в 30 раз повышенной устойчивостью к ингибитору. Как это объяснить? Все ли 6 замен повлияли на наблюдаемый эффект, или какие-то закрепились случайно, а какие-то - в результате положительного отбора? Если так, то какие именно замены наиболее значимы - и почему? Давайте разберемся!
На рис. 1 показана протеаза ВИЧ так, как мы бы могли ее видеть в очень точном атомно-силовом микроскопе, "ощупывающем" поверхности микрообъектов. Как легко заметить, молекула представляет собой димер. Рассмотрение молекулы с других ракурсов (см. рис. 2 и 3) позволяет понять, что димер составлен из двух идентичных субъединиц - т.е. протеаза является гомодимером. Между субъединицами отчетливо видна сквозная полость. Отнесение этого фермента к классу протеаз означает, что он катализирует реакцию гидролиза пептидной связи. Белки ВИЧ синтезируются в виде одного непрерывного полипептида и для дальнейшего функционирования должны быть разделены. Этим и занимается ВИЧ протеаза, а регион полипептида, связь которого разрезается, как раз должен быть помещен в наблюдаемую нами полость.
Одна из стратегий борьбы с вирусом ВИЧ заключается в подборе молекулы - ингибитора протеазы. Такая молекула (см. рис. 4-6) связывается в той же полости, где должен связаться пептид, тем самым занимая его место и не "пуская" его внутрь. В то же время ингибитор не имеет гидролизуемой пептидной связи и, соответственно, не разрезается протеазой, а остается связанным на долгое время, выводя тем самым фермент из строя. Однако эта инактивация не терминальна - ингибитор не взаимодействует с ферментом ковалентно и может покинуть полость. На равновесие между связанной и несвязанной формой влияет количество и тип благоприятных нековалентных взаимодействий между аминокислотными остатками белка, формирующими полость, и ингибитором. Потеря любого такого взаимодействия приведет к сдвигу равновесия в сторону несвязанной формы и, соответственно, повысит вероятность фермента выполнить свою функцию. Возможно, какие-то из 6 замен именно так и действуют?
Из шести замен боковые радикалы только двух располагаются вблизи связанного ингибитора (см.рис. 7). В исходном ферменте это остатки Phe53 и Val81. В силу симметрии всего комплекса эти два остатка, взятые от разных субъединиц, оказываются близко друг к другу, "зажимая" между собой ингибитор. В новом устойчивом варианте оба заменены на меньшие по размеру, что нарушает точное соответствие формы ингибитора форме кармана связывания (см. рис. 8). Это позволяет молекулам воды проникнуть в образовавшиеся полости. Ингибитор и карман связывания являются гидрофобными, и соседство с молекулами воды является неблагоприятным и дестабилизирует комплекс. Помимо этого, Phe53 вступал в особое благоприятное нековалентное взаимодействие между ароматическими группами - Т-стэкинг - которое исчезает при замене его на неароматический лейцин. Описанные эффекты и приводят к ухудшению эффективности ингибитора в 30 раз.
Подготовлено с использованием материалов с сайта PDB-101