Обзор генома и протеома бактерии Brucella suis 1330

Резюме

В работе представлены результаты исследования генома и протеома бактерии Brucella suis 1330. Был проанализирован GC-состав в двух ДНК (57%), была рассчитана частота встречаемости k-меров (k=3), также число гипотетических белков, производился поиск рибосомальных белков и рРНК, рассчитывалось число генов белков, псевдогенов, генов РНК на прямой и обратной цепи.

Ключевые слова

Brucella suis 1330, GC-состав, рибосомальные белки, k-меры, биологическое оружие.

Сокращения: а.о. – аминокислотные остатки, п.н. – пары нуклеотидов, B.suis 1330 – Brucella suis 1330, cb – Compositional Bias, O/E (Observed/Expected), ВСК.

Введение

Brucella suis 1330 патогенная бактерия семейства Brucellaceae. Грам-отрицательная альфа-протеобактерия, вызывающая бруцеллёз – опасное заболевание, которым страдают не только крупный рогатый скот, но и человек^[1].
Болезнь провоцирует аборт и мертворождение у свиней. Впервые штамм был секвенирован в 2002 году, в 2011 было проведено повторное секвенирование. Данный вид использовали в качестве биологического оружия американские военные^[2].
Число нуклеотидов равно 3315175. Количество хромосом у Brucella suis 1330 равно двум, а количество генов белков, кодирующих аминокислотные последовательности, - 3273. Обе хромосомы имеют кольцевую структуру.

Таксономия: Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Brucellaceae; Brucella^[3].

Материалы и методы

Для написания обзора последовательность генома и данные о протеоме бактерии была взята из сайта NCBI^[4]. Для обработки данных использовались:

• Методы работы с электронными таблицами (Excel из пакета MS Office):
1. Импорт, создание плоской таблицы, переименование листов;
2. Копирование, вставка, фильтры, удаление, сортировка по одному или нескольким элементам в порядке возрастания/убывания;
3. Связь таблиц, находящихся на нескольких листах, с помощью функции ВПР (VLOOKUP);
4. Форматирование (изменение ширины столбцов) и оформление таблицы;
5. Вставка и удаление формул, знака «$» для правильного распространения формул вниз и вправо;
6. Метод специальной вставки, добавление примечаний (комментариев);
7. Создание сводных таблиц;
8. Вставка графиков, гистограмм, диаграмм;
9. Вставка функций: СЧЁТЕСЛИМН, ЕСЛИОШИБКА, ЕСЛИМН, ХИ2.ОБР, СТАНДОТКЛОН.В, МЕДИАНА, МОДА, МИН, МАКС;
10. Поиск и замена значений или символа с помощью клавиш Ctrl+F, Ctrl+H.
• Программы:
1. geecee – для вычисления количества комплиментарных пар GC;
2. wordcount -wordsize 3 – для подсчёта числа встреч k-меров (k=3) в геноме;
3. cbcalc -s -K – для подсчёта ожидаемого числа встреч k-меров (k=3) в геноме и отношения Observed/Expected;
4. seqret -ossingle2 – для разбиения одного файла на два, содержащих информацию о каждой ДНК.

Результаты и обсуждение

Анализ генома

На листе «genes» в сопроводительных материалах содержится список генов белков и ДНК бактерии Brucella suis 1330. Геном B.suis 1330 представлен двумя хромосомами.
Длина ДНК на первой хромосоме (идентификатор NC_004310.3) составляет 2107794 п.н., на второй (идентификатор NC_004311.2) – 1207381 п.н. Следовательно, длина всего генома составляет 3315175 п.н. В геноме встречаются гены, кодирующие белки, рибосомальные и транспортные РНК, псевдогены. Их встречаемость приведена в таблице 1.
Частота пары G-C была подсчитана с помощью программы geecee. В итоге, GC-состав у Brucella suis 1330 на двух хромосомах одинаковы и составляют 57% от общего числа нуклеотидов в геномных ДНК, как представлено на листе «GC_content» в сопроводительных материалах. У данной бактерии процентный GC-состав выше, чем у почти всех представленных альфа-протеобактерий в Table 2^[5], но ниже, чем у Gluconobacter oxydans 621H (60.8%) и Rhodopseudomonas palustris BisB18 (65%).
Из электронной таблицы, присутствующей в сопроводительных материалах (лист «genes_per_type»), видно, что больше всего в геноме встречается генов, кодирующих протеины, и меньше всего тех, которые кодируют рибосомальные РНК. Вдобавок, на листе «chance_genes» в сопроводительных материалах отмечено, сколько генов каждого типа встречается на прямой и обратной цепи. В результате, на прямой цепи («+») гены рРНК отсутствуют, а на обратной («-») присутствуют.
Был проведён анализ k-меров в геноме (k=3). Для начала мы использовали программу wordcount -wordsize 3, которая подсчитала частоту встречаемости каждого 3-мера в геноме (информация присутствует на листах «3-mers-4310» и «3-mers-4311» электронной таблицы в сопроводительных материалах). Затем при помощи программы cbcalc -s -K подсчитали ожидаемые и наблюдаемые значения встреч 3-меров. Подсчитали cb (Compositional Bias, или BCK), равное «наблюдаемое / ожидаемое».
Результаты можно увидеть на рисунке 1 и в сопроводительных материалах (листы «3-mers-cb-4310» и «3-mers-cb-4311»).

Анализ протеома

На листе «chance_genes» в сопроводительных материалах содержится информация о количестве генов, кодирующих белки, тРНК и рРНК, и псевдогенов по цепям ДНК. В итоге, на прямой цепи («+») содержится 1419 генов белков, на обратной («-») – 1461 ген. Данные результаты мы получили с помощью функции СЧЁТЕСЛИМН (таблица Excel).
Было также проанализировано, является ли распределение генов белков случайным. Примем в качестве нулевой гипотезы (Н0) предположение о том, что распределение в обеих цепях случайно. Степень свободы (df) равна 1, а уровень значимости (α) – 0.05 (доверительная вероятность (р), соответственно, 1 – 0.05 = 0.95). В ходе исследования было установлено, что критерий Пирсона наблюдаемого значения (χ2набл) намного меньше, чем χ2крит, вычисленный при помощи формулы ХИ2.ОБР (значения χ2 можно найти в справочных таблицах). Следовательно, принимается гипотеза Н0 о случайном распределении генов белков по обеим цепям ДНК, и отвергается альтернативная гипотеза (Н1).
На рисунке 2 представлена гистограмма распределения длин белков B.suis 1330. Видно, что наиболее представленным диапазоном длины 249-301 а.о. Максимальную длину имеет белок «autotransporter outer membrane beta-barrel domain-containing protein» (протеин бета-цилиндр, автотранспортёр наружной мембраны, содержащий домен), равную 3420 а.о. Минимальную – «50S ribosomal protein L36» (50S рибосомальный белок L36).

Стандартное отклонение было посчитано с помощью функции СТАНДОТКЛОН.В и получилось равным, в результате, 209.4548169. Медиана и мода были рассчитаны с помощью соответствующих функций. Результаты вычислений представлены на листе «protlen» в сопроводительных материалах.
Из таблицы, находящейся в сопроводительных материалах (лист «hypprot»), следует, что гипотетические белки занимают всего 9.375% (всего их 270) от общего количества белков в протеоме данного штамма. На листе «ribprot» приведён список названий, координат и ориентаций рибосомальных белков и рибосомальных РНК. Данные были получены из листа «genes» той же электронной таблицы с помощью применения фильтра и копирования на нужный лист «ribprot».
Интересно заметить, что все гены рибосомальных РНК располагаются на обратной цепи ДНК; количество генов рибосомальных белков на прямой цепи равно четырнадцати.

Заключение

Таким образом, была проведена большая работа с геномом бактерии Brucella suis 1330, в которой были освещены темы, посвящённые исследованию и анализу генома (размер самого генома, наличие генов разных типов, наличие и распределение k-меров, GC-состав) и протеома (количество гипотетических и рибосомальных белков, исследование длин различных белков) прокариота. Исследование позволяет дополнить информацию о геноме данного прокариота, что поможет в будущем.

Сопроводительные материалы

Сопроводительные материалы (таблица Excel на kodomo): ссылка.

Листы:
• «feat_table» - хромосомная таблица.
• «genes» - плоская таблица с генами.
• «genome_size» - таблица с длиной генома.
• «genes_per_type» - сводная таблица с генами каждого типа.
• «GC_content» - маленькая табличка, содержащая информацию о G-C-составе (в каждой хромосоме).
• «3-mers-4310», «3-mers-4311» - 3-меры для каждой хромосомы.
• «3-mers-cb-4310», «3-mers-cb-4311» - расчёт cb 3-меров для каждой хромосомы.
• «chance_genes» - табличка с числом генов белков, псевдогенов, РНК, а также с расчётами χ2-критерия.
• «protlen» - таблица с генами, кодирующими белки, и гистограмма с длиной белков.
• «hypprot» - число всех гипотетических белков.
• «ribprot» - таблица с информацией о рибосомальных белках и РНК (названия, координаты, начало и конец).

Благодарность

Мы выражаем благодарность всему преподавательскому составу факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. Ломоносова за помощь в освоении гранита науки, интересную подачу материала и организацию занятий.

Список литературы

1. Tae H., Shallom S., Settlage R., Preston D., Adams L.G. and Garner H.R. Revised Genome Sequence of Brucella suis 1330. J Bacteriol. 2011; 193(22): 6410. DOI: 10.1128/JB.06181-11.
2. Winstead E.R. Potential bioweapon, Brucella suis, is sequenced. Genome News Network, 2002.
3. Paulsen I.T., Seshadri R., Nelson K.E., Eisen J.A., Heidelberg J.F., Read T.D., Dodson R.J., Umayam L., Brinkac L.M., Beanan M.J., Daugherty S.C., Deboy R.T., Durkin A.S., Kolonay J.F., Madupu R., Nelson W.C., Ayodeji B., Kraul M., Shetty J., Malek J., Van Aken S.E., Riedmuller S., Tettelin H., Gill S.R., White O., Salzberg S.L., Hoover D.L., Lindler L.E., Halling S.M., Boyle S.M., Fraser C.M. The Brucella suis genome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts. J PNAS. 2002; 99(20):13148-53. DOI: 10.1073/pnas.192319099.
4. Источник с последовательностью генома и с данными о протеоме бактерии Brucella suis 1330.
5. Lightfield J., Fram N.R., Ely B. Across Bacterial Phyla, Distantly-Related Genomes with Similar Genomic GC Content Have Similar Patterns of Amino Acid Usage. PLoS One. 2011; 6(3): e17677. DOI: 10.1371/journal.pone.0017677..