1. Глобальное парное выравнивание гомологичных белков

Для проведения выравнивания было предварительно выяснено, какие мнемоники белков повторяются у Escherichia coli и Bacillus subtilis. Для этого через Uniprot (расширенный поиск) были найдены, а затем скачаны ID и RecName всех белков этих организмов. Затем в Excel была применена функция ВПР, и в итоге остались лишь те идентификаторы, которые повторяются (с помощью метода разделения столбцов были получены списки мнемоник). Результат можно увидеть здесь.
Для исследования были выбраны белки со следующими мнемониками: ALF, 6PGD, RRF. Выравнивание проводилось с помощью программы needle (опция -auto). Результаты выравнивания представлены в таблице 1.

Таблица 1. Глобальное парное выравнивание для гомологичных белков у Escherichia coli и Bacillus subtilis.
Protein Name ID 1 ID 2 Score % Identity % Similarity Gaps Indels
Fructose-bisphosphate aldolase class 2[1] ALF_ECOLI ALF_BACSU 279.0 25.3% 41.0% 98 16
6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating[2] 6PGD_ECOLI 6PGD_BACSU 1718.0 70.0% 83.4% 3 3
Ribosome-recycling factor RRF_ECOLI RRF_BACSU 469.0 48.6% 71.9% 0 0

2. Локальное парное выравнивание гомологичных белков

Для локального выравнивания применялась программа water (опция -auto). Результаты выравнивания представлены в таблице 2.

Таблица 2. Локальное парное выравнивание для гомологичных белков у Escherichia coli и Bacillus subtilis.
Protein Name ID 1 ID 2 Score % Identity % Similarity Gaps Indels Coverage 1 Coverage 2
Fructose-bisphosphate aldolase class 2[1] ALF_ECOLI ALF_BACSU 289.0 27.5% 43.2% 78 13 88.0% 89.1%
6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating[2] 6PGD_ECOLI 6PGD_BACSU 1719.0 70.1% 83.6% 3 3 100% 100%
Ribosome-recycling factor RRF_ECOLI RRF_BACSU 470.0 48.9% 72.3% 0 0 100% 100%
    Значения длин белков со следующими ID (в аминокислотных остатках):
  • ALF_ECOLI: 359;
  • ALF_BACSU: 285;
  • 6PGD_ECOLI: 468;
  • 6PGD_BACSU: 469;
  • RRF_ECOLI: 185;
  • RRF_BACSU: 185.
    Разночтения в полном имени белков:
  • [1] ALF_BACSU: Probable fructose-bisphosphate aldolase.
  • [2] 6PGD_BACSU: 6-phosphogluconate dehydrogenase, NADP(+)-dependent, decarboxylating.

    • 3. Результат применения программ выравнивания к неродственным белкам

    Для выполнения этого задания были выбраны белки с разной мнемоникой: END8_ECOLI (Endonuclease 8) и PURL_BACSU (Phosphoribosylformylglycinamidine synthase subunit PurL). Было проведено выравнивание для того, чтобы выяснить, есть ли схожесть структуры. Результаты представлены в таблице 3.

    Таблица 3. Глобальное и локальное парное выравнивания для негомологичных белков у Escherichia coli и Bacillus subtilis.
    Alignment Score % Identity % Similarity Gaps Indels Coverage 1 Coverage 2
    Needle-align 25 4.5% 7.5% 699 24
    Water-align 40 19.4% 33.1% 54 9 44.1% 20.2%

    Исходя из итоговых результатов, делается вывод, что оба белка действительно негомологичны (для выявления гомологии необходимо более 25% сходства). Однако процент идентичности и схожести в локальном выравнивании выше, чем в глобальном, поскольку сравнивались совершенно разные участки аминокислотной последовательности (у E.coli - со 2 по 177 а.о, а у B. subtilis - с 507 по 656 а.о).

    4. Множественное выравнивание белков и импорт в Jalview

    Из первого задания была выбрана мнемоника 6PGD (6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating), для которой был запущен сеанс поиска в UniProt (в разделе Swiss-Prot). В итоге, нашлось 55 белков (включая 6PGD1_YEAST и 6PGDH_BACSU). Среди них, помимо белков E. coli и B. subtilis, были выбраны: 6PGD_HUMAN, 6PGD_SHEEP, 6PGD_SHISO, 6PGD_STAAC, 6PGD_HAEDU. Проект в Jalview: скачать, скриншот.

      Множественное выравнивание для данных белков проводилось на сайте Uniprot с последующей работой в Jalview:
    1. После поиска белков с заданными параметрами и выбора любых пяти из списка нажать на флажок рядом с белком;
    2. Кликнуть на кнопку "Align", расположенную над таблицей с результатами поиска;
    3. Подождать некоторое время, пока программа сделает то, что должна;
    4. Нажать на кнопку "Download", выбрать fasta-формат в выпадающем списке и "uncompressed";
    5. Когда откроется в браузере страничка с fasta-форматом, кликнуть на правую кнопку мыши, затем на "сохранить как", указать "все файлы", убрать расширение txt;
    6. Ждать окончания загрузки;
    7. Загрузить fasta-файл в Jalview (сначала закрыть лишние окна): "File" > "Input alignment" > "From file" > выбрать скачанный файл:
    8. "Colour" > "Percentage identity" в меню для нашего выравнивания (для раскраски по проценту идентичности);
    9. "File" > "Save project as" > выбрать формат "jvp".
    Комментарии к выравниванию: структуры исследуемых белков довольно на друг друга похожи, лишь стоит отметить, что у 6PGD_SHEEP выпадают с 1 по 12 и с 446 по 485 а.о., у последних трёх белков - с 469(470) по 485 а.о. Некоторые участки во всех белках полностью идентичны (консервативны), например: 13-16, 18-19, 34-35, 34-35, 69-70, 78-79, 100-104, 128-133, 179-182 и далее (раскрашены тёмно-сиреневым цветом). Колонки 184-189 и 440-457 консервативные, однако у первого и третьего белка произошла замена аминокислот на 441 и 443 позиции, а у предпоследнего - на 191 месте.
    Интересны 23-26 колонки, где у первых трёх белков совпадает последовательность между собой, а у остальных четырёх - различается, но между собой тоже идентичны. Полностью неконсервативные участки есть (например, 37, 80 столбцы); они довольно немногочислены и обычно их всего по одному столбцу.
    Выравнивание показывает возможную гомологию белков.

    5. Выравнивание своего белка с его гомологом

    Для данного задания был взят белок, представленный в третьем блоке по Uniprot. В качестве сравниваемого был взят белок A0A5C0XMV7_PYRFU Pyrococcus furiosus (из UniProt TrEMBL), так как ни один белок из Swiss-Prot со схожей мнемоникой не является возможным гомологом GTPазе с GPN-петлёй (процент идентичности сильно меньше 25%). Результаты представлены в таблице 4.

    Таблица 4. Глобальное и локальное парное выравнивания для гомологичных белков у Pyrococcus abyssi и Pyrococcus furiosus.
    Alignment Score % Identity % Similarity Gaps Indels Coverage 1 Coverage 2
    Needle-align 1084.0 79.4% 90.7% 0 0
    Water-align 1084.0 79.4% 90.7% 0 0 100% 100%
      Значения длин белков со следующими ID (в аминокислотных остатках):
    • GPN_PYRAB (GPN-loop GTPase): 248;
    • A0A5C0XMV7_PYRFU (GTPase): 248.
    Это свидетельствует о гомологии, так как нет ни вставок, ни делеции, и последовательности сильно схожи. Процент схожести более 25%.

    6. Параметры программ needle и water

    Программы needle и water запрашивают следующие параметры, будучи написанны без опции -auto:

    • Первая последовательность (причём, скачанная из БД предварительно);
    • Вторая последовательность;
    • Штраф за открытие гэпа (10 по умолчанию);
    • Штраф за удлинение гэпа (0.5 по умолчанию);
    • Выходной файл (в квадратных скобках указан файл, название которого выдумала программа, добавляя туда .needle (.water); название - по второму входному файлу

    Изменяя третий и четвёртый параметры, изменяется длина выравнивания (length), вес (score), % идентичности, схожести, число гэпов и инделов, например (аналогично для water):

    1. needle 1.txt 2.txt 0.2 0.9 eno_align.needle
    2. needle 1.txt 2.txt 20 8 eno_align.needle
    3. needle 1.txt 9.txt 20 8 eno_align.needle
    По умолчанию стоят значения 10.0 (штраф за открытие гэпа) и 0.5 (штраф за удлинение гэпа). Если вставить параметры, которые меньше заданных (пример 1), то характеристики выравнивания изменяются (числа уменьшаются); больше параметров по умолчанию (примеры 2 и 3) - увеличиваются характеристики.
    Программы принимают как файлы, скачанные через entret, так и через seqret: в txt, fasta, raw-форматах. Если добавить -aformat fasta к выходному файлу, то программа выдаст выравнивание в этом формате; там окажутся только названия белков и сами последовательности без характеристик.
    Примечание: в файлах 1.txt, 2.txt содержится полная информация о белках eno_bacsu, eno_ecoli соответственно (скачаны через entret). В файле 9.txt (пример 3) - второй белок, скачанный через seqret.