Особенности мембранных белков

Задание 0. Основная информация.

✧ С помощью базы данных OPM были отобраны структуры трех трансмембранных бета-баррелей и трех трансмембранных альфа-спиральных белков, причем произвольных. Ниже в таблице представлена информация о них.

PDB код	Тип (спираль, баррель)	Какая мембрана (внутренняя или внешняя, организм, органелла)	Толщина гидрофобной части мембраны в ангстремах	Медиана числа остатков в одном трансмембранном участке
1I78	Beta-barrel	Bact. Gram-neg outer, Escherichia coli	26.5 ± 1.6	9.4
4FUV	Beta-barrel	Bact. Gram-neg outer, Acinetobacter baumannii	25.0 ± 2.3	6.5
1XKW	Beta-barrel	Bact. Gram-neg outer, Pseudomonas aeruginosa	24.8 ± 1.0	8.3
1YQ3	Alpha-helical	Mitochon. inner, Gallus gallus	29.6 ± 1.8	22.8
3RVY	Alpha-helical	Bact. Gram-neg inner, Arcobacter butzleri	29.6 ± 0.4	21
2MGY	Alpha-helical	Mitochon. outer, Mus musculus	28.6 ± 1.6	19

Задание 1. Отбор гомологов.

✧ Моей жертвой стал белок с идентификатором 2JAF. Необходимо отобрать 10-20 гомологов. Для этого прошел в NCBI BLAST, исключил (Exclude) таксон archaea (taxid:2157), поскольку данный белок принадлежит организму Halobacterium salinarum из архей. В расширенных настройках: Expect threshold = 1, а поиск по базе refseq_protein. На 09.04.14 было 170 находок, отобрал 13 гомологов с хорошим e-value. Также не брал гипотетические белки. Ниже прикреплен fasta-файл с белковыми последовательностями.

Ссылка на белковые последовательности

Задание 2. Анализ структуры белка 2JAF.

Еще одна полезная ссылка TCBD

PDB ID	Организм	Тип мембраны	TC-код	Угол наклона спиралей к нормали	Количество трансмембранных спиралей
2JAF	Halobacterium salinarum	Плазматическая мембрана	3.E.1.2.1*	0 ± 1°	7

* - TC-код - 3.E.1.2.1 - Halorhodopsin, являющийся каналом для анионов Сl¯, что же значат все эти обозначения?

Cl¯ (out) + hν -> Cl¯ (in)

3.* - первичные транспортеры
3.E.* - транспортеры, использующие энергию света hν
3.E.1* - семейство ион-транслокационных микробных родопсинов (MR)
3.E.1.2.1 - Halorhodopsin

Задание 3. Анализ множественного выравнивания трансмембранных белков.

✧ Было построено множественное выравнивание с помощью Muscle, окрашивание Hydrophobicity, с порогом консервативности 25%. Ссылка на выравнивание в формате jar и изображение выравнивания - ниже.

Ссылка на полученное выравнивание в формате jar

Были добавлены 2 аннотации:

1)"TM_REAL" - показывает α-cпирали моего белка 2JAF, ниже представлено изображение структуры, откуда брались координаты α-спиралей.

2) "TM_PREDICTED", выданная программой TMHMM для гомолога, а именно для YP_001767533.1, структура которого нeизвестна. Ниже изображение.

Затем к выравниванию (к моему белку) была добавлена 3D-структура. Необходимо повернуть её так, чтобы было понятно, где n и p стороны. N-сторона (Negative) находится из соображения, что в ней много положительно заряженных аминокислотных остатков (Lys, His, Arg). Изображение ниже.

Ответы на вопросы. Ниже снова представил изображение с выравниванием, на этот раз пронумеровав спирали, для удобства.

•1) Как видно из выравнивания, участки с трансмембранными спиралями образуют консервативные блоки. Наиболее часто встречаются следующие аминокислотные остатки: Лейцин,Изолейцин, Тирозин, Пролин, Аспартат, Треонин, Аланин/Глицин, Метионин
•2) Между второй и третьей трансмембранными спиралями есть плохо выровненные участки. Также между седьмой и восьмой спиралями есть небольшой такой участок выравнивания, причем у всех белков, кроме XP_003838574.1
•3) В трансмембранных спиралях есть следующие консервативные столбцы, состоящие из:
а) полярных положительно заряженных остатков: аргинина(R), причем находится этот столбец в наиболее консервативной, третьей спирали
б) полярных отрицательно заряженных остатков: аспартат(D), находится столбец в той же третьей спирали, но не полностью консервативен. Что интересно, есть полностью консервативный столбец в восьмой спирали.
в) полярных незаряженных: тирозина(Y) - сильные консервативные столбцы в 3-х спиралях; треонина(T) - сильно консервативные 2 столбца, вместе со столбцом пролина в третьей спирали

✧ Разница между TM_real TM_predicted. В действительности есть 10 спиралей. Для гомолога программа предсказала лишь 7, причем предсказанные спирали практически полностью совпадают в реальными. Можно конечно говорить о том, что программа работает плохо, однако есть 2 весомых факта:
1) не получена структура данного гомолога
2) если открыть pdb-файл в JMol, и покрутить немного белок, можно заметить достаточно интересную вещь. Между 5 и 6 спиралями есть 2 остатка, которые выпетливаются, однако визуально, это выглядит, как одна спираль. Тоже самое можно сказать и о 8,9 и 10 спиралях, 10-ая "выворачивается" практически перпендикулярно всем остальным на поверхности клетки. Посмотрев в JMol, определил, что так сильно "выворачивают" спираль именно Asn255 и Asn256, что полностью совпадает в выравниванием. Так что с допущениями, можно сказать, что спиралей 7, что совпадает в предсказанием для гомолога.