Практикум 8

Нуклеотидный BLAST

Автор старался, но не может гарантировать отсутствие биологических ошибок.

1. Разные варианты BLAST для фрагмента ДНК

• blastn

  Program version: BLASTN 2.14.1+.
  Поиск проводился при трех разных длинах слов: 7, 11, 15. При длине затравки 7: находок 734. При длине затравки 11: находок 659. При длине затравки 15: находок 254. Получается, что число находок падает с увеличением длины затравки, потому что совпадать должны уже более крупные участки. Наиболее схожая последовательность в любом случае принадлежала Sceloporus undulatus (предполагаемо кодирует мРНК альфа-3 щелевого соединения), с e-value в 4e-146. Совпадение результатов в первых строчках по e-value возможно указывает на значительное влияние длины затравки только на выравнивание менее схожих последовательности. Графическое представление результатов на рисунке 5.
  blastn - поиск по гену в нуклеотидной базе данных. Алгоритм следует использовать для поиска гомологичных последовательностей среди не близкородственных видов.





• megablast

  Program version: BLASTN 2.14.1+.
  При длине затравки 16: находок 197, наиболее схожая последовательность совпадала с blastn, но e-value вырос до 5e-112. При длине затравки 28: находок 12 и больше всего наблюдалось сходство с участком генома Hemicordylus capensis (тоже предполагаемо кодирует мРНК альфа-3 щелевого соединения), e-value = 8e-110. Графическое представление результатов на рисунке 6.
  Участки совпадения получаются намного меньше по длине чем при blastn. megablast - более точный поиск по гену в нуклеотидной базе данных. Программа может находить последовательности с высоким процентом идентичности среди близкородственных видов.

• blastx

  Program version: BLASTX 2.14.1+.
  При длине затравки 5: находок 571. При максимальной длине затравки в 6 число находок падает всего на две до 569. Наиболее схожая последовательность принадлежала Anolis carolinensis и уже представляла собой не мРНК, а сам белок альфа-3 щелевого соединения, e-value = 2e-138. Также программа распознала консервативный домен connexin (белки, кодирующие щелевые соединения). Графическое представление результатов на рисунках 7 и 8.

  

  Участки выравнивания увеличиваются по сравнению с выравнвианиями относительно геномных последовательностей. Результаты намекают на предпочтительность поиска гомологов по белковым базам данных для кодирующих последовательностей. blastx - поиск по гену в белковой базе данных. Режим находит белки со схожими функциями по отношению к продукту трансляции кодирующей последовательности гена.



• tblastx

  Program version: TBLASTX 2.14.1+.
  Поиск велся при длине затравки 3 (по умолчанию), но разным базам данных. При поиске по коллекции нуклеотидов (nucleotide collection, по умолчанию): 813 находок. Общий объем базы для Unidentata: 1,206,757 последовательностей (6,366,500,533 букв). Больше всего наблюдалось сходство с участком генома Lacerta agilis (предполагаемо кодирует мРНК альфа-3 щелевого соединения), e-value = 1e-131. Из интереса был также произвден поиск по репрезентативным геномам RefSeq (refseq_representative_genomes): 199 находок. Общий объем базы для Unidentata: 313,290 последовательностей (27,884,400,230 букв). Больше всего наблюдалось сходство с участком генома Podarcis muralis (последовательность - участок 4 хромосомы), e-value = 2e-125. Графическое представление результатов на рисунках 9 и 10.
  В общем, получается, что более качественные с точки зрения выравнивания находки можно обнаружить в коллекции нуклеотидов, которая предлагается по умолчанию. tblastx - поиск по гену в транслированной нуклеотидной базе данных. Алгоритм можно использовать если известен ген ранне изученного белка и хочется проверить присутствуют ли его гомологи в сборке генома, где не предсказаны гены.

2. Поиск в геноме эукариота генов основных рибосомальных РНК по далекому гомологу

После многодневных страданий, связанных с установкой blast+, удалось получить локальный BLAST на своем ноутбуке. Далее была проведена индексация последовательности генома P. leo:

$ makeblastdb -in 'P.leo_genomic.fasta' -dbtype 'nucl'

Были скачены последовательности рРНК E. coli из преложенного файла. В файле содержались следующие рРНК:

• 16S рРНК - часть малой субъединицы рибосомы прокариот (аналог 18S для эукариот). 3'-конец участвует в инициации трансляции и связывании с мРНК. Также обеспечивает связывание большой и малой субъединиц рибосомы и стабилизацию кодон-антикодонового взаимодействия в А-сайте.
• 23S рРНК - часть большой субъединицы рибосомы прокариот, образующая пептидил-трансферазный центр (аналог 28S для эукариот). Зачастую антибиотики ингибирующие трансляцию связываются именно с этим сайтом. Считается, что последовательность 23S рРНК более изменчива, чем у других рРНК.

Локальный поиск BLAST проводился отдельно для последовательности каждой рРНК в файле: 16S и 23S (последовательности были разделены на соответствующие txt файлы). Для поставленной задачи выбрала blastn, потому что работала с последовательностями некодирующих генов для неблизкородственных организмов (эукариоты и прокариоты). Локальный поиск для каждой рРНК:

$ blastn -task blastn -query 16S_rRNA.txt -db P.leo_genomic.fasta -out ~/blast16.out -evalue 0.05

$ blastn -task blastn -query 23S_rRNA.txt -db P.leo_genomic.fasta -out ~/blast23.out -evalue 0.05

Файлы с результатами BLAST для 16S и 23S рРНК.
Размер затравки был оставлен 11 (по умолчанию для blastn), evalue опущено до 0.05 (как в веб-версии). Остальные параметры запуска касались исключительно расположения и названия файлов. Для анализа результатов показалась удобнее выдача для 16S и 23S в формате таблицы (добавление параметра -outfmt со значением 7):

$ blastn -task blastn -query 16S_rRNA.txt -db P.leo_genomic.fasta -out blast16.out -evalue 0.05 -outfmt 7

$ blastn -task blastn -query 23S_rRNA.txt -db P.leo_genomic.fasta -out blast23.out -evalue 0.05 -outfmt 7

Для обоих последовательностей рРНК удалось найти гомологов.
Для 16S рРНК число находок = 7, для всех есть аннотация и все соответствуют участкам 18S рРНК генома P. leo. Идентификаторы гомологичных 18S рРНК (по порядку следования выравниваний): XR_006196888.1, XR_006196890.1, XR_006196891.1, XR_006196892.1, XR_006196893.1, XR_006196895.1, XR_006196894.1. Не смотря на малую длину покрытия в 43 п.н. (при длине последовательности 16S рРНК для E. coli в 1556 п.н.), мне эти находки не кажутся случайными, потому что все гомологичные участки соотвествуют рРНК и участок выравнивания у E. coli был постоянным (1494..1536).
Для 23S рРНК число находок = 31. Из значимых и приятных находок - 28S рРНК (их идентификаторы: XR_006196897.1, XR_006196898.1, XR_006196902.1, XR_006196899.1, XR_006196901.1, XR_006196896.1). Примечательно, что находок для 28S рРНК по четыре на каждую и каждый раз картировался иной фрагмент последовательности E.coli на иной фрагмент генома P. leo, причем порядок следования фрагментов соблюдался. На мой взгляд, это подтверждает, гомологию эукариотических рРНК с данной прокариотической. Из интересного: для XR_006196899.1 найденные гомологичные последовательности были перевернуты во всех четырех случаях (возможно у львов произошла инверсия для данной рРНК). Остальные 7 находок не представляют особого смысла (3 фрагмента не имели аннотации, 3 аннотировались на белок XM_042916655.1, 1 на белок XP_042772540.1).

Список источников

1. 16S рРНК;
2. 23S рРНК.

//а также все гиперссылки, присутствующие в смысловой части практикума