Составление репрезентативной выборки гомологов белка ybbD_BACSU с помощью BLAST

Для составление репрезентативной выборки гомологов белка был произведен поиск с помощью BLAST среди большинствва филумов прокариот и среди эукариот. Такой поиск не ограничивает число результатов, но облегчает работу с более чем 4 тысячами хитов. Для поиска по каждому филуму прокариот (по базе RefSeq) в поле Organism исключались эукариоты и включался соответствющий филум бактерий. Порог по e-value бфл установлен везде одинаковый - 10е-5 (такой высокий, потому что выдается колоссальное количество хитов, столько и не нужно). Далее из результатов выбиралось несколько наиболее идентичных последовательностей. Потом из них составлялось дерево в GenBank. Результаты поиска можно посмотреть в таблице 1, а последовательности отобранных белков в фаста-формате можно скачать здесь.

Результаты поиска с помощью BLAST

Группа	Ограничения по таксонам	Порог по e-value	Максимальное количество хитов	Число взятых в выборку	Идентификаторы в RefSeq
a-proteobacteria	a-proteobacteria	10e-5	607	1	YP_001832004.1
b-proteobacteria	b-proteobacteria	10e-5	322	2	ZP_02355965.1, ZP_02463814.1
d-proteobacteria	d-proteobacteria	10e-5	97	1	ZP_21237458.1
g-proteobacteria	g-proteobacteria	10e-5	1775	5	ZP_23550178.1, ZP_15940755.1, YP_341561.1, ZP_08408924.1, ZP_10279984.1
cyanobacteria	cyanobacteria	10e-5	144	2	ZP_05025562.1, YP_478540.1
chlorobi group	chlorobi group	10e-5	1374	4	ZP_20983629.1, YP_006433559.1, YP_004238974.1, YP_006426314.1
Actinobacteria	Actinibacteria	10e-5	1023	3	ZP_03298131.1, YP_643411.1, ZP_08287378.1
Spirochaetes	Spirochaetes	10e-5	216	2	YP_005061787.1, ZP_09659728.1
Tenericutes	Tenericutes	10e-5	3	1	YP_001620280.1
Chlamydiae	Chlamydiae	10e-5	25	1	ZP_06299899.1
Euryarchaeota	Euryarchaeota	10e-5	114	1	YP_004785994.1
Остальные	exclude (Eukarya, Proteobacteria, Euryarchaeota, Chlamidiae, Tenericutes, Spirochaetes, Actinibacteria, Chlorobo group, Cyanobacteria, Tenericutes)	10e-5	262	3	YP_003322188.1, ZP_08554226.1, ZP_06392296.1

Табл.1. Таблица параметров поиска BLAST и отобранных в результате белков.

На рисунке 1 представлена репрезентативность выборки по прокариотам.

Рис.1. Распределение выбранных белков по таксонам прокариот.

Встречаемость белка у эукариот

Для того, чтобы оценить встречаемость белка ybbD_BACSU у эукариот, был запущен поиск BLAST по Eukaryota. Т.к. хитов вышло немного, сразу все результаты были отправлены в GenBank, составлено дерево и выбрано 11 последовательностей из разных таксонов. Их таксономическую связь можно увидеть на рисунке 2. Последовательности этих белков в фаста-формате можно скачать здесь.

Рис.2. Распределение выбранных белков по таксонам эукариот.

В таблице 2 можно ознакомиться со всеми отобранными организмами, у которых обнаружен гомолог белка ybbD_BACSU.

Домен	Филум	Организм	Белок
Archaea	Euryarchaeota	Haloarcula hispanica ATCC 33960	YP_004785994.1
Bacteria	Actinobacteria	Collinsella stercoris DSM 13279	ZP_03298131.1
	Actinobacteria	Rubrobacter xylanophilus DSM 9941	YP_643411.1
	Actinobacteria	Streptomyces griseoaurantiacus M045	ZP_08287378.1
	Bacteroidetes/Chlorobi group	Fulvivirga imtechensis AK7	ZP_20983629.1
	Bacteroidetes/Chlorobi group	Flexibacter litoralis DSM 6794	YP_006433559.1
	Bacteroidetes/Chlorobi group	Weeksella virosa DSM 16922	YP_004238974.1
	Bacteroidetes/Chlorobi group	Ornithobacterium rhinotracheale DSM 15997	YP_006426314.1
	Chlamydiae/Verrucomicrobia group	Parachlamydia acanthamoebae str. Hall's coccus	ZP_06299899.1
	Cyanobacteria	Coleofasciculus chthonoplastes PCC 7420	ZP_05025562.1
	Cyanobacteria	Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)	YP_478540.1
	Firmicutes	Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168	ybbD_BACSU
	Proteobacteria	Beijerinckia indica subsp. indica ATCC 9039	YP_001832004.1
	Proteobacteria	Burkholderia oklahomensis EO147	ZP_02355965.1
	Proteobacteria	Burkholderia thailandensis MSMB43	ZP_02463814.1
	Proteobacteria	Cystobacter fuscus DSM 2262	ZP_21237458.1
	Proteobacteria	Morganella morganii SC01	ZP_23550178.1
	Proteobacteria	Morganella morganii subsp. morganii KT	ZP_15940755.1
	Proteobacteria	Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125	YP_341561.1
	Proteobacteria	Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505	ZP_08408924.1
	Proteobacteria	Pseudoalteromonas arctica A 37-1-2	ZP_10279984.1
	Spirochaetes	Sphaerochaeta pleomorpha str. Grapes	YP_005061787.1
	Spirochaetes	Leptonema illini DSM 21528	ZP_09659728.1
	Synergistetes	Dethiosulfovibrio peptidovorans DSM 11002	ZP_06392296.1
	Tenerecutes	Acholeplasma laidlawii PG-8A	YP_001620280.1
	unclassified Bacteria	Thermobaculum terrenum ATCC BAA-798	YP_003322188.1
	unclassified Bacteria	Haloplasma contractile SSD-17B	ZP_08554226.1
Eukaryota	Archaeplastida	Zea mays	NP_001146552.1
	Archaeplastida	Fragaria vesca subsp. vesca	XP_004301317.1
	Archaeplastida	Glycine max	XP_003554030.1
	Chromalveolata	Phytophthora infestans T30-4	XP_002907074.1
	Opisthokonta	Trichoplax adhaerens	XP_002118719.1
	Opisthokonta	Puccinia graminis f. sp. tritici CRL 75-36-700-3	XP_003307054.2
	Opisthokonta	Myceliophthora thermophila ATCC 42464	XP_003665722.1
	Opisthokonta	Sordaria macrospora k-hell	XP_003352972.1
	Opisthokonta	Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255	XP_002568350.1
	Opisthokonta	Aspergillus oryzae RIB40	XP_001820553.2
	Opisthokonta	Sclerotinia sclerotiorum 1980	XP_001591716.1

Табл.2. Встречаемость белка в различных таксонах.

Множественное выравнивание гомологов белка ybbD_BACSU

Было проведено множественное выравнивание гомологов белка при помощь программы Muscle. Её результаты можно видеть на рисунках 3-4.

Рис.3. Выравнивание гомологов белка ybbd_BACSU из прокариот.

Рис.4. Выравнивание гомологов белка ybbd_BACSU из эукариот. Использовано окрашивание Clustalx. ДЛя того, чтобы развернуть рисунки, просто откройте их в новой вкладке.

Из этих рисунков можно заметить, что лучше выравниваются последовательности прокариот между собой, эукариотические же сохранили же несколько важных блоков, но с большей изменчивостью в составе.

Результаты анализа множественного выравнивания гомологов белка ybbD_BACSU

Для анализа были добавлены дополнительные строки аннотации: Secondary, Ligand, Blocks.
SECONDARY: отражает нахождение альфа-спиралей и бета-листов в структуре 3BMX белка ybbD_BACSU.
LIGAND: отражает, те АК, которые связывают лиганды - ионы натрия, находящий рядом с ними ацетат-ион, а также исследуемый ранее лиганд P4G.
BLOCKS: отражает блоки на участках выравнивания.
Получившийся результат можно рассмотреть на рисунке 5.

Рис.5. Выравнивание со всеми последовательностями как из прокариот, так из эукариот. Добавлены новые строки аннотации. Окрашивание АК: His, Arg, Lys - розовый; Glu, Asp - голубой; Ala, Leu, Ile, Met, Val - серый; Phe, Trp, Tyr - синий; Asn, Gln - темно-зеленый; Cys - желтый; Pro - салатовый. Окрашивание по консервативности с порогом 30%.

После анализа множественного выравнивания стало ясно, что лучше (с большим процентом идентичности) выравнялись прокариотические последовательности. Но абсолютно все сиквенсы имееют несколько участков, которые мало отличаются друг от друга, такие участки были объединены в блоки (см. рис.5). Трудно угадать какую-то зависимость элементов вторичной структуры от консервативных участков, но с уверенностью можно сказать, что аминокислоты, связывающие ионы натрия и ацетат-ион, находятся в блоках, а это значит, что они несут функциональну нагрузку и необходимы для выполнения белком своих функций. Посмотреть, как связан лиганд в структуре 3BMX белка ybbD_BACSU можно на рисунках 6-7.

Рис.6-7. Связывание лигандов Na и ацетат-иона.

HIS222 и LYS221 строго консервативны у всех, у прокариот консервативны также Ser233, Val187, Arg191, у эукариот они заменяются на Тhr (Gly,Glu,Asn), Gly (Arg) и Glu соответственно. Phe173 рандомно заменяется на тирозин, лейцин и метионин. Val177 может заменяться на изолейцин, аланин или тирозин. Из этого можно сделать вывод, что лиганд-связывающие аминокислоты консервативны и заменяются только на схожие по радикалу АК. (Взаимозаменяемость тирозина и АК с гидрофобными радикалами можно объяснить тем, что тирозин своим фенольным кольцом может обеспечивать те же гидрофобные взаимодействия).