>

Учебный сайт Макаровой Надежды

Восстановление кристалла из PDB файла

Структура кристалла белка

Для работы был выбран белок с PDB ID: 1MQ7. Это дУТФ нуклеотидгидролаза (далее dUTP-ase) из бактерии MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.
В поле CRYST1 PDB-файла содержится следующая запись: 

CRYST1   98.823   98.823   98.823  90.00  90.00  90.00 I 2 3        24
Из этих данных можно узнать:
  • Длины направляющих векторов кристалла:
    • a = 98.823
    • b = 98.823
    • c = 98.823
  • Углы между направляющими векторами кристалла:
    • α = 90˚
    • β = 90˚
    • γ = 90˚
  • Кристаллографическая группа симметрии кристалла по символике Германа-Могена: I 2 3
  • Число молекул в ячейке: 24

Асимметрическая единица состоит из одной цепи А; активная форма белка (биологическая сборка) представляет собой гомотример (представлен на Рисунке 1).

C помощью команды: 

symexp new_symexp, 1mq7,1mq7, 40
получили изображение расположения соседних с данной молекул в структуре кристалла. То есть,мы построили повторяющиеся объекты 1mq7, удаленные не более чем на 40 Å от объекта 1mq7. В результате были получены изображения укладки молекул в кристалле. Результат приведён на Рисунке 2. В одной ячейке 8 тримеров.

Рисунок 1. Биологическая сборка dUTP-ase — гомотример.
Ассиметрическая единица выделена серым цветом

Рисунок 2. Фрагмент кристалла с выделенной элементарной ячейкой. Для наглядности тримеры покрашены в разные цвета, а также один из них показан только в виде ассиметрической единицы.

Не очень ясно, почему элементарная ячейка содержит 8 одинаковых тримеров, вместо 1. Это бы заняло меньше памяти. Возможно есть альтеранативные конформации, но они не были заемечены. ДРугая гипотеза связана с числом контактов между тримерами. Как мы в дальнейшем сможем убедиться каждый трмер образует большое количство гидрофильных взаимодействий с соседними. Возможно такая биологическая особенность, как олигомеризация, послужила причиной выделить столь большую ячейку.

Анализ внутрикристаллических контактов

  • Внутри гомотримера (биологической сборки) 

    • fetch 1mq7
symexp symp1, 1mq7, 1mq7, 2, 1
bg_color white
set transparancy, 0.5
select 1mq7_polar, symbol n+o and 1mq7 and not het
select sur_polar, symbol n+o and not 1mq7 and not het

select this, byres (1mq7_polar within 3.5 of sur_polar)
show sticks, this
set stick_radius, 0.2
color green, this

select that, byres (sur_polar within 3.5 of 1mq7_polar)
show sticks, that
color blue, that

distance hbonds, this, that, 3.5, mode=2
set dash_width, 3
set dash_color, yellow

    Еще на Рисунке 1 можно заметить, что мономеры в составе тримера расположены очень близко друг к другу. У асимметрической единицы есть выдающийся из белковой глобулы С-конец, которым три мономера цепляются друг за друга. На Рисунке 3 показан гомотример dUTP-ase. Сначала были выделены два множества полярных остатков самой ассиметрической единицы и двух других субъединиц тримера. Затем было выбрано множетсво тех остатков ассиметрической единицы, которые могут образовывать водородные связи с полярными остатками окружения (двух других субъединиц). Саму ассиметрическую единицу обозначили поверхностью и покрасили в салатовый цвет, а важные остатки, которые отвественны за стабилизацию тримера выделили ярко зеленым цветом и воспроизвели в шарнирной модели. Аналогичный действия провели и с остатками окружения. Результат представлен на Рисунке 3. Во-первых, можно заметить симметрию полярных взаимодействий в тримере. Во вторых, длины связей довольно малы (см. Рисунок 4), что свидетельствует о прочном взаимодействии мономеров в составе гомотримера. В третьих, полярные взаимодействия экранированы от поверхности и сосредоточены внутри тримера. Это может подразумевать, что, таким образом, создается внутренний корман для катализируемой реакции.

    Рисунок 3. Гомотример белка dUTP-ase. Одна исходная субъединица (она же ассимметрическая единица) покрашена в салатовый цвет. Две другие, которые были получены с помощью программы symexp, окрашены в светлоголубой цвет. Ярко зеленым ив шарнирной модели выделены те остатки исходной субъединицы, которые содержат группы, способные образовать водородные связи с остатками из других субъединиц. Ярко синим обозначены аналогичные остатки, но у сосдених субъединиц в гомотримере.

    Рисунок 3. Пример полярных взаимодействий между мономероами в составе тримера. Полярные взаимодействия здесь - водородные связи, которые обохначены желтой пунктирной линией. Цифрой обозначена длина связи в А. Цветовое разделение прежнее: зеленым обозначена ассимметрическая единица, а синим - окружение. Для наглядности несколько остатков из окружения имеют раскраску по атомам.

  • Между гомотримерами внутри ячейки

    • Так как у нас в одной ячейке целых восемь тримеров, их контакты будут такими же, как и в других ячейках и как на границе ячейки. Контакты разделим на гидрофобные и гидрофильные и посмотрим, какие вносят наибольший вклад. На Рисунке 4 представлены полярные контакты между тримерами. На самом деле их больше, но чтобы было нагляднее, было выбрано три соседних тримера. Очевидно, гидрофильных взаимодействий в кристалле, меньше чем внутри тримера.

    Рисунок 3. Пример полярных взаимодействий между гомотримерами в составе элементарной ячейки. Полярные взаимодействия здесь - водородные связи, которые обохначены желтой пунктирной линией. Цветовое разделение: зеленым обозначен тример, а красным - окружение.

    Гидрофобных взаимодействий обнаружено не было.

    Вывод:Отдельные молекулы белка образуют достаточно большое количество связей между собой, что подтверждает успешное проведение процесса кристаллизации. Вероятно, контакты между белками, входящими в один гомотример, по данным PDB файла, отражают их природные взаимодействия.

    Пример и объяснение странного расположения белковых цепей в структуре ДНК-белкового комплекса

    Из банка PDB была скачана структура ДНК-белкового комплекса 3HDD (Рисунок 4). Это комплекс представляет собой транскрипционный фактор Engrailed, связанный с ДНК. Этот белок содержит гомеодомен. Гомеодомен – это тип белковой укладки "спираль-поворот-спираль". Он состит из трех соединенных короткими петлями альфа-спиралей, одна из которых связывает консервативный сайт TAAT. На Рисунке 4 цепь А обозначена зеленым цветом, цепь В - желтым цветов, а ДНК - серым.

    Рисунок 4. Ассиметрическая единица pdb файла 3HDD комплекса гомеодомена с ДНК Желтым выделена цепь B, зеленым - цепь А.

    Сама структура комплекса, если рассмотреть одну ячейку, кажется странной, так как один гомеодомен - цепь В (желтый цвет) расположена на самом краешке ДНК. Маловероятно, что торцевой белок достаточно прочно связался с ДНК, так как для этого недостаточно места.

    Однако, если достроить соседние ячейки при помощи команды symexp, то можно получить изображение, представленное на Рисунке 5. На нем можно видеть, что молекулы ДНК из соседних ячеек расположены линейно и, самое главное, имеют липкие концы, которые образуют водородные связи и стэкинг-взаимодействия.

    Рисунок 5. Две соседние ячейки кристалла комплекса гомеодомена с ДНК Желтым выделена цепь B, зеленым - цепь А.

    Цепь В образует водородные связи как с ДНК из исходной ячейки (см. Рисунок 6), так и с ДНК из соседней ячейки (см. Рисунок 7). Помимо этого цепь В также взаимодействует с аналогичным белком, но из совсем другой ячейки. В дальнейшем будут рассматриваться только ДНК-белковые взаимодействия в кристалле (так как белок-белковые были рассмотрены выше) Место разрыва ДНК - это сайт посадки гомеодомена. Надо заметить, что контактов с соседней ячейкой у гомедомена значительно меньше, чем с ДНК из своей ячейки.

    Рисунок 6. Водородные связи между цепью B (гомеодомен) и ДНК внутри одной и той же ячейки

    Рисунок 7. Водородные связи между цепью B (гомеодомен) исходной ячейки и ДНК соседней ячейки

    Вывод: Странное расположение торцевой молекулы белка в структуре объясняется наличием в кристалле других молекул ДНК и белков. Они расположены в соседних ячейках и не видны в исходной структуре, однако взаимодействуют с ней. Не стоит забывать, что исходно мы смотрим только на малую часть кристалла. Однако существует еще множество ячеек, каждая из которых влияет на расположение молекул в соседних ячейках и поддерживает структуру кристалла.

    Ассиметрическая единица и биологическая единица

    Ассиметрическая единица кристалла - минимальная часть кристалла, с помощью которой можно восстановить элементарную ячейку и затем весь кристалл с помощью операций кристаллографической симметрии (см. Рисунок 8).

    Рисунок 8. Схематичное изображение получения элементарной ячейки и кристалла из ассиметрической единицы. Взято из pdb.

    Биологическая единица (биологическая сборка) - это молекула, для которой существует информация (эксперментальная или точно предсказанная), что она функционально активна. Ассиметрическая и биологические единицы не обязаны совпадать. Например, dUTP-ase активна в форме тримера, однако ассиметрической единицей является мономер.

    Бывает и так, что одна ассиметрическая едница содержит несколько биологических. Пример - структура гемоглобина 1hv4 (см. Рисунок 9). Одна ассиметрическая единица включает 2 биологических. Возможная причина - две функциальных биологических единицы не полностью идентичны.

    Рисунок 9. Пример структуры, когда одна ассиметрическая единица состоит из двух биологических единиц. Cтруктура с pdb: 1hv4. Раскарска по биологическим единицам.