Учебный сайт Анастасии Тепловой

Семестры

Предсказание генов прокариот

Информация о плазмиде

• ID – CP005089
• Организм – Sphingobium sp. Таксономия
• Размер – 53908 пар нуклеотидов

1. Работа с EMBOSS

C помощью EMBOSS скачали последовательность плазмиды cp005089 в форматах gff и fasta.
seqret embl:cp005089 plasmid.fasta
Файл plasmid.fasta содержит полную нуклеотидную последовательность плазмиды.
embl:cp005089 -feature plasmid.gff
В файле plasmid.gff сохранены особенности последовательности, и оттуда с помощью скрипта CDS_only.py можно извлечь интересующую нас информацию о координатах кодирующих белки последовательностей.
CDS_plasmid.gff

2. Предсказание Prodigal

Программа Prodigal используется для предсказания генов прокариот. Она запускается из командной строки.
<'PATH'>prodigal.exe -i plasmid.fasta -o plasmid_prod.gff -f gff
-i – файл, который подается программе на вход -o – выходной файл программы -f – формат выходного файла – мы выбрали формат gff.

3. Обработка результатов предсказания

Теперь мы хотим получить информацию о количестве правильно и неправильно предсказанных генов. Для этого используем скрипты на Python.

Подготавливаем файлы с помощью скрипта CDS_only.py
cds_plasmid.gff
cds_prod.gff
Аннотировано 76 генов, предсказано 80.

Check_prediction_equal.py – базовый скрипт. Получает на вход файлы cds_plasmid и cds_prod и имя выходного файла записывает файл сds_plasmid.gff с аннотированными генами в переменную а – типа list записывает файл cds_prod.gff предсказанными генами в переменную р – типа list Читаем по одной строке файл файл с предказанными генами. Разбиваем строку по символам табуляции. Переменной start присваиваем координату начала гена, переменной stop – координату конца. Ищем в файле annotated.gff ген с такой же координатой начала. Если такая есть, проверяем равенство координат конца. Считаем количество совпадающих генов с помощью счетчика. Выводим в выходной файл список совпавших генов, чтобы можно было проверить правильность работы. В stdout выводим число правильно предсказанных генов.

Получилось 55 генов. Список совпадающих генов: eq.out

Для подсчета генов, у которых правильно предсказан только N- или только C-конец, используем модификации базового скрипта. Учитываем ориентацию гена. На комплементарной цепи меньшая координата – С-конец гена, большая – N-конец.
Check_prediction_equal_start.py – ищет гены у которых неправильно предсказан С-конец и правильно предсказан N-конец.

программа выдает 0 – таких генов нет

Check_prediction_equal_stop.py – ищет гены у которых неправильно предсказан N-конец и правильно предсказан C-конец.

11 генов 5 на прямой и 6 на комплементарной. Список генов: eqstop.out
Количество генов, которые предсказаны неправильно, вычисляем с помощью простой арифметики:
80 - 55 - 11 = 14 генов предсказано неверно.

4. Причины несовпадения

Посмотрим в геномном браузере несколько генов для которых не совпала аннотация одного из концов. Заметим, что нет генов, для которых Prodigal правильно предсказал N-конец, но ошибся в предсказании С-конца. Для 11 генов Prodigal верно предсказал С-конец, но ошибся в выборе стартового кодона. Посмотрим список этих генов.

  #genes
		start	stop	chain
predicted	7538	7801	+
annotated	6521	7801	+

predicted	10623	10823	+
annotated	10614	10823	+

predicted	18103	18555	+
annotated	18250	18555	+

predicted	23449	24156	+
annotated	23842	24156	+

predicted	24904	25662	+
annotated	24919	25662	+

predicted	37819	37472	-
annotated	37777	37472	-

predicted	41203	40877	-
annotated	41221	40877	-

predicted	44834	44460	-
annotated	44861	44460	-

predicted	48940	48485	-
annotated	48931	48485	-

predicted	53045	52629	-
annotated	53075	52629	-

predicted	53463	53011	-
annotated	53490	53011	-

  

Рассмотрим ген с координатами 10614..10823 в геномном браузере.

Prodigal неверно предсказал стартвый кодон этого гена и предсказанный ген немного короче аннотированного. Как мы видим на картинке рядом находятся два возможных стартовых кодона ATG (10614..10616 и 10623..10625). Это привело к ошибке программы.

Еще один пример: 37777..37472. Также ошибка в выборе стартового кодона. В позиции 37819..37817 стоит последовательность ATG – потенциальный стартовый кодон. Но на самом деле координата N-конца гена – 37777

Вообще неправильно предсказанный ген (20724..20993) на комплементарной цепи. Аннотированы гены (20196..20642) и (21020..21280), причем эти гены правильно предсказаны Prodigal.

Посмотрим последовательность:

>gi|998169651|gb|CP005089.1|:20724-20993 Sphingobium sp. TKS plasmid pTK5, complete sequence

CTATCGCGACCCCGGCGTTGCGCCGGCGTCGGGTTCCTTGTTCGCAGCTCCGGCCGGCGG
CCGCGTAGCATGCTCCGCACAGCTCACCCCTTCATTCCCTGCATTACAACCAGCTCCATC
ATTCTGCTGCACCACCACCAGGCGTGCCGTTGAGCTGTTGTTGCCGGGGTTAGGATCCAC
GACCCCCGCAGGTGGAGTCACCGTGGCCGTGCTGACTAGCCGCAGCCGCCTAGCGGCCCG
CAGCGGTGGCCGGGGAACCGGCCACCGCAC

	

Это последовательность прямой цепи, а ген предсказан на комплементарной. Это означает, что стартовый кодон GTG, а стоп-кодон ТАG. Стоп-кодон точно не противоречит таблице генетического кода.

Насчет стартового кодона информация с сайта NCBI:
"Tаблица 11 используется для Бактерий, Архей, прокариотических вирусов и хлоропластных белков. Наиболее эффективна инициация по стартовому кодону AUG. Для Архей и Бактерий были задокументированы стартовые кодоны GUG и UUG. В E. coli, UUG служит инициатором для приблизительно 3% белков, а CUG известен как инициатор одного закодированного в плазмиде белка (RepA). В дополнение к инициации через NUG, в редких случаях у Бактерий может наблюдаться инициация трансляции кодоном AUU, как, например, в случае poly(A) полимеразы PcnB и гена InfC, кодирующего фактор инициации трансляции IF3." [1]

Т.е. формально начало и конец гена могут быть такими, но на самом деле, ген с данной последовательностью, с данными координатами не существует.

© Anastasia Teplova 2016