Чтение последовательностей по Сэнгеру
Упр.1) Прочитать последовательность ДНК на основании данных, полученных из капиллярного секвенатора по Сэнгеру. Составить отчёт о проблемах при чтении хроматограмм.
С помощью программы Chromas Lite были прочитаны прямая и обратная последовательности ДНК. Файлы *.ab1, полученные из капиллярного секвенатора, можно скачать:
Прямая последовательность - L50_COI_F_G05_WSBS-Seq-07-10-16.ab1
Обратная последовательность - L50_COI_R_G06_WSBS-Seq-07-10-16.ab1
Были визуально определены границы нечитаемых участков. Для Прямой последовательности на 5' конце - 1-67, на 3' конце было читаемо до конца (хотя под конеч качество ухудшилось).
На Обратной последовательности на 5' конце всё было читаемо (хотя были полиморфизмы), на 3' конце - 576-704.
Кроме того, качество прочтения хроматограммы существенно падает в окрестности начальных и конечных нечитаемых участков.
Шум занимает не более 10% от хроматограммы, за исключением концевых участков (вплоть до 50%) и совершенно забивают сигнал в нечитаемых участках.
Пики Гуанина в Прямой последовательности были гораздо меньше остальных, что в некоторых случаях приводило к нераспознованию нуклеотида программой, а иногда и к ошибкам.
В Обратной последовательности подобного не наблюдалось и сигнал был в целом сильнее.
По ссылке доступны отредактированные Прямая и Обратная последовательности.
Скачать проект Jalview с выравниванием прямой и обратной последовательностей
Ниже предоставлены участки, потребовавшие ручной коррекции. На первом рисунке приведён пример, когда на из-за пятна краски произошёл резкий рост пиков, в результате чего один нуклеотид был пропущен, а ещё два неверно определены. Правильные данные получены на основе обратной цепи.
Рис 1
На втором рисунке представлен участок, где ошибочно был обнаружен гуанин, хотя на самом деле должен присутствовать цитозин. Правильные данные получены на основе обратной цепи.
Рис 2
На 3 и 4 рисунках показаны полиморфизмы, которые не удалось исправить, поскольку вторая цепь в этом участке была совершенно нечитаема (и этому времени удалена).
Рис 3
Рис 4
Упр.2)Приведите пример нечитаемого фрагмента хроматограммы
Ниже приведены нечитаемые участки хроматограмм, которые были вырезаны на этапе ручной корректировки.
Рис 5
Рис 6
Источники:
[1] Презентация к 6 занятию.
© Матвеев Андрей, 2017 AD