Практическая работа №14: Сборка генома de novo

wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR424/008/SRR4240378/SRR4240378.fastq.gz

TrimmomaticSE SRR4240378.fastq.gz SRR4240378_trim.fastq.gz ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:7:7

Вывод программы:

Input Reads: 4420587 Surviving: 4338744 (98.15%) Dropped: 81843 (1.85%)
TrimmomaticSE: Completed successfully

Адаптерами оказалось 1.85% чтений.

TrimmomaticSE SRR4240378_trim.fastq.gz SRR4240378_trimf.fastq.gz TRAILING:20 MINLEN:32

Вывод программы:

Input Reads: 4338744 Surviving: 4154738 (95.76%) Dropped: 184006 (4.24%)
TrimmomaticSE: Completed successfully

Удалено 184 006 чтений (4.24%).

velveth Assem 31 -fastq -short ../SRR4240378_trimf.fastq 

velveth Assem 31 -fastq -short SRR4240378_trimf.fastq

Итог сборки:

N50 - 7028 bp Максимальная длина контига - 36 746 bp Общее количество нуклеотидов - 657 295 bp Число контигов - 369

3. Анализ контигов

Для дальнейшего анализа были выбраны три наиболее длинных контига:

grep ">" Assem/contigs.fa | sort -t_ -k4,4nr | head -3

Объяснение параметров: grep ">" — ищет все строки с описанием контигов sort -t_ — разделитель полей нижнее подчёркивание _ -k4,4nr — сортировка по 4-му полю (длина) в обратном порядке head -3 — покажет топ 3

>NODE_8_length_36746_cov_20.017199
>NODE_57_length_19371_cov_20.546642  
>NODE_15_length_16745_cov_20.901762

Контиг	Длина (bp)	Покрытие
NODE_8	36 746	20.02
NODE_57	19 371	20.55
NODE_15	16 745	20.90

Аномалии покрытия

Среднее покрытие по всем контигам составляет 16.9 ( Использовали команду: grep ">" Assem/contigs.fa | awk -F'_' '{sum+=$6; count++} END{print "Среднее покрытие:", sum/count}'). Контиги, покрытие которых более чем в 5 раз отличается от этого значения, могут указывать на возможные ошибки сборки или биологичнские особенности.

Расчитаем пороги для аномалий (отличаются от медианы более чем в 5 раз):

• Нижний порог: 16.9 / 5 ≈ 3.4
• Верхний порог: 16.9 × 5 ≈ 84.5

Контиги с аномально высоким покрытием (>84.5×):

grep ">" Assem/contigs.fa | awk -F'_' '$6 > 84.5' | head -5

Контиги с аномально низким покрытием (<3.4×):

grep ">" Assem/contigs.fa | awk -F'_' '$6 < 3.4' | head -5

Oбнаружены следующие аномалии:

1. Контиги с аномально высоким покрытием:
NODE_19: длина 2,106 bp, покрытие 100.56× (в 5.95 раз выше среднего 16.9×).
Возможно, представляет повторяющийся регион (например, рибосомные гены).
NODE_81: длина 934 bp, покрытие 102.75× (в 6.08 раз выше среднего).

2. Контиги с аномально низким покрытием:
NODE_166: длина 64 bp, покрытие 2.84× (в 5.95 раз ниже среднего).
Вероятно, ошибка сборки или загрязнение.
NODE_271: длина 31 bp, покрытие 3.23× (в 5.23 раз ниже среднего).
NODE_281: длина 72 bp, покрытие 2.94× (в 5.75 раз ниже среднего).

4. Сравнительный анализ с референсным геномом

Для сравнения был выбран полный геном Buchnera aphidicola штамма из тли Schizaphis graminum (accession: NZ_CP029205.1), длина: 630 854 bp.

Каждый из трёх самых длинных контигов был сравнен с референсным геномом с помощью программы Megablast.

1. Первый контиг: NODE_8_length_36746_cov_20.017199 (рис.1)

Координаты участка хромосомы: Sbjct: 87013–91478.
Соответствующий участок контига располагается в пределах: Query: 2248–6761

Характеристики выравнивания

• Длина выравнивания: 4514 п.н.
• Число совпадающих нуклеотидов: 3722 (≈82%)
• Число однонуклеотидных различий: 792
• Число гэпов: 72 (≈1%)
• E-value: 0.0
• Покрытие контига выравниванием 74%

В результате BLAST-поиска был обнаружен один значимый хит, соответствующий хромосоме референсного генома. Выравнивание характеризуется нулевым E-value, что указывает на его высокую статистическую значимость. На графике видно, что контиг выравнивается с хромосомой несколькими фрагментами, которые имеют одинаковую ориентацию и располагаются последовательно вдоль одного участка хромосомы. Это указывает на то, что данный контиг действительно соответствует участку бактериального генома.

2. Второй контиг: NODE_57_length_19371_cov_20.546642 (рис.2)

Координаты участка хромосомы: Sbjct: 16750–27901.
х Соответствующий участок контига располагается в пределах: Query: 8183–19577

Характеристики выравнивания

• Длина выравнивания: 11 395 п.н.
• Число совпадающих нуклеотидов: 8 676 (≈76%)
• Число однонуклеотидных различий: 2 719
• Число гэпов: 478 (≈4%)
• E-value: 0.0
• Покрытие контига выравниванием 97%

График локального сходства демонстрирует непрерывную ровную линию, что указывает на соответствие исследуемого контига одному протяжённому участку хромосомы выбранной бактерии и подтверждает их гомологию.

3. Третий контиг: NODE_15_length_16745_cov_20.901762 (рис.3)

Координаты участка хромосомы: Sbjct: 457626–465787.
х Соответствующий участок контига располагается в пределах: Query: 6315–14573

Характеристики выравнивания

• Длина выравнивания: 8 259 п.н.
• Число совпадающих нуклеотидов: 6 540 (≈79%)
• Число однонуклеотидных различий: 1 719
• Число гэпов: 190 (≈2%)
• E-value: 0.0
• Покрытие контига выравниванием 56%

Неполное покрытие (56%) может объясняться различиями между анализируемым штаммом и выбранным референсом, а также особенностями de novo сборки (короткие чтения, возможные разрывы/сложно собираемые участки). При этом достаточно высокий процент идентичности в выровненных частях показывает, что совпавшие фрагменты соответствуют бактериальному геному и не являются случайными.