Поиск сигналов. Теория

Задание 1. Определение биологической роли определенного транскрипционного фактора в бактерии

Мы проводили ииследование на Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
LexA_Myco.fasta - файл с участками ДНК, с которыми связывается данный транскрипционный фактор.
Сначала нужно с помощью программы MEME найти мотив связывания. Однако, данной программе нельзя подавать одинаковые последовательности, поэтому файл был отфильтрован с помощью скрипта meme.py, и был получен fasta файл c 57 gjcktljdfntkmyjcnzvb без повторений - single_LexA.fasta. Эта программа безумно медленная.

              [0.017544, 0.000000, 0.000000, 0.982456], 
              [0.035088, 0.947368, 0.017544, 0.000000], 
              [0.035088, 0.000000, 0.964912, 0.000000], 
              [1.000000, 0.000000, 0.000000, 0.000000], 
              [0.894737, 0.000000, 0.000000, 0.105263], 
              [0.087719, 0.877193, 0.000000, 0.035088], 
              [0.508772, 0.017544, 0.368421, 0.105263], 
              [0.122807, 0.280702, 0.280702, 0.315789], 
              [0.543860, 0.052632, 0.263158, 0.140351], 
              [0.000000, 0.000000, 0.017544, 0.982456], 
              [0.000000, 0.000000, 1.000000, 0.000000], 
              [0.035088, 0.000000, 0.000000, 0.964912], 
              [0.000000, 0.000000, 0.175439, 0.824561], 
              [0.000000, 1.000000, 0.000000, 0.000000], 
              [0.000000, 0.000000, 0.894737, 0.105263], 
              [0.771930, 0.070175, 0.140351, 0.017544] .
           

Далее полученный мотив нужно было отправить на вход программе tomtom, ищущей похожие мотивы, предсказанные для этого транскрипционного фактора в базе данных RegTransBase.

              [0.486624, 0.000588, 0.000588, 0.512200], 
              [0.000691, 0.000588, 0.000588, 0.998133], 
              [0.000691, 0.026164, 0.128465, 0.844680], 
              [0.128568, 0.537673, 0.026164, 0.307596], 
              [0.998133, 0.000588, 0.000588, 0.000691], 
              [0.895831, 0.000588, 0.000588, 0.102992], 
              [0.998133, 0.000588, 0.000588, 0.000691], 
              [0.000691, 0.998031, 0.000588, 0.000691], 
              [0.640077, 0.000588, 0.358644, 0.000691], 
              [0.384322, 0.358644, 0.128465, 0.128568], 
              [0.230869, 0.358644, 0.230767, 0.179718], 
              [0.000691, 0.384220, 0.026164, 0.588926], 
              [0.000691, 0.000588, 0.998031, 0.000691], 
              [0.000691, 0.026164, 0.000588, 0.972558], 
              [0.026266, 0.000588, 0.000588, 0.972558], 
              [0.000691, 0.000588, 0.000588, 0.998133], 
              [0.282020, 0.026164, 0.563249, 0.128568], 
              [0.819105, 0.000588, 0.000588, 0.179718], 
              [0.154143, 0.230767, 0.051739, 0.563351], 
              [0.282020, 0.102890, 0.026164, 0.588926] 
           

В Таблице 2 находка с похожей PWM была выбрана как первая находка, т.е. с минимальным E-value. Также Таблица 2 и Рис. 2 помогают сравнить находки tomtom и сайта, найденного МЕМЕ. Во-первых, находка короче, начинается со второго нуклеотида сайта и заканчивается за 2 до конца, и есть 2 несовпадающих консервативных нуклеотида.
Далее найденный MEME мотив данного транскрипционного фактора нужно подать на вход программе FIMO с поиском по БД upstraem region, эта программа найдет данный мотив в регионах перед генами. Мотив нужно искать только в upstream region, потому что большинство транскрипционных факторов связываются с последовательностью до гена по направлению транскрипции (т.е. в upstream region).
Файл с координатами сайтов связывания ТФ - fimo_upst.txt.
Далее нужно найти координаты всех генов данной бактерии, по заданию это можно сделать с помощью команды featcopy из пакета emboss. Но в моем случае почему-то featcopy не распознавал ncRNA как feature, поэтому пришлось написать скрипт на питоне - gene_coord.py. В итоге был получен файл с координатами генов - Myco_genes.txt.
Далее необходимо найти гены, экспрессию которых может регулировать ТФ. Считается, что ТФ регулирует экспрессию ближайшего гена в той же ориентации, что и сайт. А в файле fimo_upst.txt во второй колонке уже указаны гены, экспрессию которых может регулировать ТФ, нужно отобрать из их достоверные находки. Я считала достоверными находки с q-value меньше 0,01, таких оказалось 30 (Таблица 3)

Однако FIMO дает только координаты мотива относительно гена, в регуляции которого он возможно участвует, поэтому необходимо найти абсолютные координаты генов и на их основе вычислить абсолютные координаты мотивов (Таблица 4).

Также в Таблице 4 указаны кодируемыми этими генами белки. Функции большинства еще не определены, а вот про белки с известными функциями стоит рассказать подробнее.
1) Diacylglycerol acyltransferase относится к группе O-ацилтрансфераз, катализирует синтез триглицеридов из диацилглицерода и Ac-CoA, поэтому этот фермент необходим для образования жировой ткани.
2) DNA polymerase III alpha subunit DnaE2 - субъединица всем известной ДНК-полимеразы III, являющейся главным ферментативным комплексом, задействованным в репликации ДНК у прокариот. Оня обладает высокой процессивностью в отличие от других ДНК-полимераз прокариот.
3) Repressor LexA - транскрипционный репрессор генов SOS-ответа, кодирующих прежде всего полимеразы с высокой частотой ошибок, репарационные ферменты ДНК и ингибиторы клеточного деления. LexA фактически представляет собой двухкомпонентную регуляторную систему с RecA, которая распознает повреждение ДНК у остановившейся репликационной вилки и преобретает активную конформацию, способную связываться с LexA, что вызывает расщепление LexA - автопротеолиз.
4) Transcriptional regulator WhiB-like WhiB2 обеспечивает защиту от иммунитета хозяина.
Так что нельзя говорить об общности всех белков, в которых был найден мотив, тут и ферменты синтеза предшественника жирных кислот и клеточной стенки, а есть и ДНК-полимераза и транскрипционные фактора, можно лишь выделить некоторые группы, например, LexA и RecA, обеспечивающие SOS-ответ.

Задание 2. Проверить, может ли метилирование повлиять на связывание исследуемого ТФ со своим сайтом?

Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, что можно рассматривать как часть эпигенетической составляющей генома.
Рассмотрим только несколько находок с самыми высокими p-value - met1, met2, met3, met4.
Программа fuzznuc пакета EMBOSS предназначена для поиска паттернов в заданной последовательности. Эта программа использовалась для поиска сайтов метилирования, пересекающихся с найденными FIMO в Задании 1 мотивами (были взяты сами мотивы и участки ± 50 нуклеотидов по бокам от них, см. файлы строкой выше). В участках искались сайты из файла MT_sites.txt, содержащего сайты метилирования:

В результате были получены файлы - fuzznuc1.out, fuzznuc2.out, fuzznuc3.out, fuzznuc4.out.
Замечтально то, что находок длиной меньше, чем 4 нуклеотида (а это минимальная длина паттерна метилирования) не было, т.е. программа искала конкретно именно эти паттерны, а не совпадения маленьких частей.

Понятно, что не все эти находки являются реальными сайтами метилтрансфераз, так как задаваемые сайты либо просто короткие, либо длинные, но с большим числом неизвестных нуклеотидов. Так что если там есть какие-то из найденных сайтов, то однозначно не все, но все равно число находок впечатляет, поэтому какие-то из них наверняка являются истинными.

Как видно на Рис. 4 у данной бактерии один из сайтов метилтрансфераз - CTGGAG. И этот паттерн был найден программой fuzznac для нашего мотива, причем 4 раза в fuzznuc1.out: pattern221, pattern222, pattern225, pattern227. Второй сайт, присутствующий у Mycobacterium tuberculosis H37Rv по данным Rebase - это GATNNNNRTAC. Этот паттерн не был обнаружен fuzznac.
Думаю, исходя из полученных данных можно говорить о влиянии метилирования на связывание ТФ со своим сайтом.