Go back

Секвенирование по Сэнгеру. Хроматограммы

Характеристика хромотограммы

В данном практикуме мне были предложены хроматограммы прямой и обратной последовательности 17_F.ab1 и 17_R.ab1
. Их требовалось проанализировать в GeneStudio или аналогичной программме, исправить ошибки, обрезать нечитаемые концы и выравнять. В процессе работы я столкнулась со следующими проблемами:

  • Для обратной последовательности не хватало кусков хроматограммы, поэтому прямую пришлось довольно сильно обрезать (1-177, 404-552). Зато эффективно обрезались и плохо читаемые фрагменты. По той же причине установить границы нечитаемых фрагментов для обратной последовательности не удалось.
  • Высокий уровень шума, из-за которого иногда сложно было понять, нужно ли редактировать последовательность, иногда по той же причине программа ставила N в некоторых местах, хотя у соседних нуклеотидов уровень шума был не ниже
  • Делеции или вставки, не знаю уж, но в некоторых местах только в одной последовательности наблюдались высокие пики, которые программа игнорировала
  • Многочисленные полиморфизмы

    • Тем не менее, результаты можно увидеть ниже:
    Консенсусная последовательность
    Выравнивание

    Проблемные места

    1) Полиморфизмы. Программа "находила" их в больших количествах, но вариантов, где я бы точна была уверена в том, что это действительно они, было немного, когда пики очень хорошо совпадали. На рисунке - один из них. 2) Также на нём виден другой вид ошибки - на 336 позиции явно видно, что в прямой последовательности есть цитозин, тогда как в обратной его нет.

    Наконец, приведу пример нечитаемого участка последовательности, с которой мне не пришлось работать, так как я её обрезала по вышеуказанным причинам. 

     Рис.1 Нечитаемый фрагмент
     Рис.2 Проблемные участки

    Нечитаемый фрагмент

    На рисунке 3 представлен фрагмент из файла "kamp3_18SIII_F_F03_WSBS-Seq-1-08-15.ab1", который, последовательность которго, очевидно нечитаема. Для начала последовательности обычно характерен высокий уровень шума, но здесь, как мне кажется, произошёл ещё и заплыв зелёной и, возможно, синей красок - на рисунке видно пятно.

     Рис.3 Нечитаемый фрагмент c предположительно заплывшей краской