Анализ транскриптомов
Подготовка чтений.
Команды
| Команда | Функция |
| fastqc chr22.1.fastq | Выдает информацию о качестве прочтений (о Quality Score сигналов) |
Число чтений - 24294, длина чтений - 25-51.
Программа Trimmomatic не использовалась, так как чтение имеет хорошее качество
Картирование чтений и анализ выравнивания.
Команды
| Команда | Функция |
| export PATH=${PATH}:/home/students/y06/anastaisha_w/hisat2-2.0.5 | Добавляет пакет программ в PATH (они становятся доступными для вызова через командную строку) |
| hisat2-build chr22.fasta chr5 | Индексирует референсную последовательность |
| hisat2 --no-softclip -x chr22 -U chr22.1.fastq -S align.sam | Строит выравнивание референсной последовательности и прочтений |
| samtools view align.sam -b -o align.bam | Переводит выравнивание в бинарный формат |
| samtools sort align.bam -T file.txt -o alignsort.bam | Сортирует выравнивание чтений с референсом по координате в референсе начала чтения |
| samtools index alignsort.bam | Индексирует отсортированный .bam файл |
| samtools stats alignsort.bam > stats.txt | Выдаёт файл со статистикой |
Из файла со статитикой видно, что 23927 прочтений картировалось, 367 - нет.
Из команды 'hisat2 ...' была убрана опция '--no-spliced-alignment', так как в случае транскриптов, прошедших процессинг, некоторые участки изначальной последовательности ДНК уже вырезаны (поэтому при картировании нужно разрешить программе выравнивать фрагменты транскриптов по отдельности
Bedtools.
Команды
| Команда | Функция |
| /P/y14/term3/block4/SNP/bedtools2/bin/bedtools bamtobed -i alignsort.bam > chr22_1.bed | Создает файл в .bed формате |
| bedtools intersect -a /P/y14/term3/block4/SNP/rnaseq_reads/gencode.genes.bed -b alignsort.bed -u > gene1.bed | Ищет перекрывание множества генов генома с множеством ридов выравнивания. -u отбираются лишь гены с ненулевым покрытием. |
Большая часть чтений(193) легла на ген белка PRAME - антиген преимущественно экспрессирующийся в меланоме, его координаты: 22893274 - 22893276. Небольшая часть(2) легла на неохарактерихованный ген LL22NC03-63E9.3, координаты: 22901750 - 22909007.
Дополнительные задания.
1. Получить из файла c выравниванием файл с чтениями в формате fastq
bedtools bamtofastq -i alignsort.bam -fq alignsort.fq
2. Объединить чтения в кластеры
bedtools cluster -i alignsort.bed -d 5 > cluster.txt
3. Разбейте свою хромосому на фрагменты по 1 млн нуклеотидов
bedtools makewindows -g chr22.txt -w 1000000 > wind.txtДлина хромосомы 51304566. Получилось 52 фрагмента
©Шкарина Анастасия Николаевна 2016