Практикум 6. Чтение последовательностей по Сэнгеру

Ход работы

Файлы с хроматограммами для прямого и обратного прочтений в формате .ab1 с навзаниями L36_COI_F_F03_WSBS-Seq-07-10-16.ab1 и L36_COI_R_F04_WSBS-Seq-07-10-16.ab1 соответственно были взяты из папки P:\y17\term3\block2\ab1_files и переименованы в direct.ab1 и return.ab1 для удобства работы. Файлы доступны для скачивания по ссылкам. Полученные файлы были открыты в программе Chromas (Lite). Масштаб был настроен таким образом, чтобы обратная цепь находилсь строго под прямой. Обратное прочтение было инвертировано опцией Reverse. Затем были удалены нечитаемые проблемные участки с концов каждой хроматограммы в режиме Continuous edit (координаты в отчёте). Хроматограммы были просмотрены на предмет ошибок. Исправления вносились строчными буквами. Отредактированные хроматограммы были сохранены в формате .ab1, последовательности - в формате .fasta. Последовательности были выровнены командой:

needle direct_edit.fasta return_edit.fasta alignment.fasta -aformat3 fasta -auto

Затем полученное выравнивание было открыто в программе JalView и раскрашено по нуклеотидам. Наконец, консенсусная последовательность была получена командой:

consambig alignment.fasta result.fasta

Отчёт

• Исходные .ab1 файлы: direct.ab1 и return.ab1.
• Характеристики хроматограмм в целом:
  • Прямое прочтение: длинный нечитаемый фрагмент вначале, более короткий в конце. В середине последовательности пики довольно четкие, спорных моментов мало. К концу хроматограммы высота шума увеличивается.
  • Обратное прочтение: длинный нечитаемый фрагмент вначале, более короткий в конце. В середине последовательности сигналы довольно четкие по сравнению с шумом, спорных моментов мало. Пики в среднем ниже, чем при прямом прочтении.
• Координаты удалённых нечитаемых участков (относительно прямой цепи после ручного выравнивания):
  • Прямое прочтение: 1 — 138; 672 — 713.
  • Обратное прочтение: -34 — 3; 472 — 673.
• Отредактированные хроматограммы: direct_edit.ab1 и return_edit.ab1.
• Полученные последовательности: direct_edit.fasta и return_edit.fasta.
• Выравнивание последовательностей: alignment.fasta.
• Консенсусная последовательность: result.fasta.
• JalView проект: alignment.jvp.
• Таблица с описанием спорных моментов:

Прочтение	№	Основание	Описание	Решение	Изображение
Прямое	1	33	Наложение нескольких сигналов одной высоты.	По обратной последовательности четко заметен аденин.
Прямое	2	81	Высокий черный пик (гуанин), программой записан тимин.	На обратной последовательности указан тимин, исправление не требуется.
Прямое	3	163	На хроматограмме заметен довольно четкий пик аденина, программа нуклеотид не распознала.	Обратное прочтение подтверждает наличие аденина. Исправить
Прямое	4	288	Пик тимина оказался не сильно выше аденина, программа не смогла определить основание.	Обратное прочтение подтверждает наличие тимина. Исправление
Прямое	5	73	2 равных по вышине пика гуанина и цитозина на небольшом расстоянии друг от друга. Программой не определены.	Обратное прочтение показывает, что на этом месте должен быть гуанин. Исправление.

Комментарий: координаты спорных моментов на обратном прочтении указаны следующим образом: <номер нуклеотида относительно прямого прочтения> (<номер нуклеотида на обратном прочтении>). Координаты на прямом протчении получаются вычитанием 135 из координат обратного прочтения.

Прочтение	№	Основание	Описание	Решение	Изображение
Обратное	1	-19 (116)	Программа не определила нуклеотид по пику хроматограммы. Прямого прочтения для данного участка нет.	На хроматограмме четко заметен пик аденина. Исправление.
Обратное	2, 3	326 (461), 329 (464)	В первом случае почти полное наложение синего и зеленого пиков. Синий (цитозин) немного выше. Во втором случае красный пик заметно выше остальных, но программой не определен.	С помощью прямого прочтения подтверждается наличие цитозина и тимина в каждом случае соответственно.

Нечитаемая хроматограмма

Поскольку использованная в задании хроматограмма оказалась довольно высокого качества, пришлось воспользоваться хроматограммой NN_G10.ab1, расположенной в папке bad. Изображение её фрагмента:

Вполне возможно, что причиной такой хроматограммы стала амплификация разных фрагментов ДНК, которые секвенировались одновременно. В результате на хроматограмме невозможно что-либо разобрать.