Практикум 1. Pymol, электронная плотность

Задание 1. PyMol

Цель задания - освоить базовые возможности интерфейса PyMol и получить приемлемую картинку лиганда с белком. Для его выполнения использовалась структура главной протеазы вируса SARS-CoV-2 с потенциальным лигандом, обозначенным как T2Y. PDB ID модели: 5REO.

Рисунок 1. Расположение лиганда T2Y по отношению к ферменту. Лиганд связан ковалентно через серу 145 цистеина, а также может формировать водородную связь с 41 гистидином.

Файл PyMol сессии: скачать.

Задание 2. Электронная плотность: хорошая и плохая расшифровки

В данном задании использовались 2 различные модели одного белка эндотиапепсина с PDB ID 3URI и 5RDH. У самих моделей единственным видимым отличием оказалось наличие молекул воды в структуре 3URI. Сразу после визуализации плотностей в PyMol командой mesh с уровнем подрезки 2 бросается в глаза, что плотность 3URI похожа местами на осколки разбитого стекла, в то время как плотности атомов у 5RDH имеют вполне округлую форму. Тем не менее, молекулы растворителя, например, вполне различимы на обеих моделях.

Для дальнейшего рассмотрения был выбран остов петли с аминоксилотами №№ 133-143 (нумерация в последовательности и структуре 5RDH совпадает, соответствие в 3URI: 132-142). Наиболее удачные визуализации их плотностей представлены ниже.

На этих изображениях можно заметить, что плотность 3URI выглядит более угловато, пришлось установить большее значение параметра carve для того, чтобы остов оказался целиком покрыт плотностью. Плохо видна зависимость между радиусом плотности вокруг атома и теоретическим радиусом данного атома. Все элементы выглядят примерно одинаково. В случае с 5RDH плотность выглядит более округло, все атомы уже покрыты плотностью при параметре carve равным 1, радиусы плотности заметно отличаются в зависимости от химического элемента. Увеличение данного параметра на модели приводит к появлению в кадре фрагментов молекул растворителя. Однако можно заметить следующую особенность: даже на уровне подрезки 0,75 не все связи между атомами оказались покрыты электронной плотностью, этого не удалось добиться и при снижении указанного параметра до 0,5.

Исходя из перечисленного выше, можно вполне резонно утверждать, что разрешение модели 5RDH значительно лучше, чем 3URI. Это подтверждается данными из PDB: разрешения структур 0.85 Å и 2.10 Å соответственно.

Задание 3. Электронная плотность и положение в структуре

Для выполнения данного задания, как и в задании 1, использовалась структура главной протеазы вируса SARS-CoV-2 с PDB ID 5REO. Ниже представлен её крупный план. Остов молекулы обозначен палочками, покрашенными в зависимости от В-фактора атома. Плотность, окружающая остов, показана сеткой с уровнем подрезки 2 и параметром carve=1.5.

Теперь на фрагменте структуры рассмотрим, как меняется покрытие остова плотностью в зависимости от уровня подрезки. На нижнем изображении справа и снизу находятся края проекции белка, а белок виртуально продолжается влево и вверх от рисунка. Уровень подрезки можно переключать под изображением.

Увеличивая уровень подрезки, можно заметить, что периферические участки быстрее перестают быть покрытыми плотоностью, чем внутренние. Окраска по B-фактору позволяет оценить подвижность атомов белка в структуре: чем "теплее" цвет фрагмента, тем он более подвижен. Соответственно, самые подвижные элементы в структуре - оранжевые, а статичные - голубые. Видно, что жёлтые и зелёные участки как раз находятся на внешней стороне белка, поэтому можно утверждать, что электронная плотность более подвижных объектов оказывается более смазанной в пространстве. Быстрее всего плотность исчезает у оранжевого "хвостика" в нижней части изображения - это C-конец протеазы. Впрочем, это неудивительно, так как данный белок входит в состав полипротеина, который затем вырезается протеазой. Соответственно, этот участок вынесен наружу и не участвует в поддержании структуры фермента для удобства разрезания.

Задание 4. Электронная плотность и типы атомов

На примере лиганда из структуры 5REO и его окружения рассмотрим зависимость между качеством электронной плотности и типами атомов, ей соответствующих. Переключая слайды ниже, можно пронаблюдать за изменением отображения электронной плотности в зависимости от уровня подрезки. Все изображения были получены с параметром carve=1.75. Лиганд покзан золотистым цветом.

На уровне подрезки 1 почти все атомы белкового окружения лиганда покрыты электронной плотностью. При этом разрешение плотности заметно хуже, чем "хорошей" плотности из задания 2. Здесь оно составляет 1.88 Å. Лиганд же практически не покрыт электронной плотностью на уровне 1. Изначально моё предположение заключалось в том, что данный лиганд слишком подвижен в кармане белка, поэтому его плотность смазана. Однако в ходе дальнейшего обсуждения выяснилось, что при множественном скрининге PanDDA плотность основной молекулы восстанавливается из всех полученных плотностей в том числе с другими лигандами. Поэтому фактическое разрешение, полученное в ходе эксперимента с T2Y хуже, чем представленное, следовательно лиганд почти не покрыт плотностью.

Полностью покрыть атомы лиганда плотностью удалось лишь на уровне подрезки 0, а на уровне 0,5 некоторые углероды ароматических колец лигнада уже перестали быть видимыми. На уровне 1 у лиганда остаётся небольшая плотность на кольцах и на радикале на месте соединения с цистеином. На уровне 2 плотность остаётся только на кислороде радикала и сере, связывающей с белком. На уровне 3 видна плотность только серы.

У белка на уровне подрезки 2 исчезает плотность алифатических углеводородных остатков, при этом остов в целом ещё покрыт плотностью. Также плотность остаётся на остатках гистидина, немного на кислородах и вполне значительно на атомах серы. На уровне 3 видны небольшие фрагменты плотности остовов, облачка гистидинов и атомы серы.

Наблюдаемая картина в целом согласуется с данными о том, что атом обладает более заметной плотностью, если у него больше электронов: вначале пропадали углероды, затем кислороды и азоты. Примечательно, что остаются видимыми ароматические остатки. Вероятно, это можно связать с тем, что атомы кольца менее подвижны, поэтому дают качественную плотность.