Седьмой семестр

Практикум 4: показатели качества рентгеноструктурной модели

Критический анализ модели феррохелатазы из Bacillus subtilis, представленной в банке PDB, код 1DOZ

D. Lecerof, Department of Molecular Biophysics Lund University, Sweden

В отчете приведены результаты анализа качества структуры феррохелатазы, расшифрованной методом РСА и содержащейся в PDB под кодом 1DOZ.

Феррохелатаза - фермент, катализирующий металлирование протопорфирина IX на последней стадии биосинтеза протогема. В бактериях феррохелатаза находится в цитоплазме, либо ассоциирована с цитоплазматической мембраной, тогда как у млекопитающих и дрожжей фермент расположен в митохондриальной мембране. Также фермент может катализировать хелатирование мезопорфирина IX и дейтеропорфирина IX in vitro дивалентными ионами Zn2+, Cu2+, Co2+. У человека редукция синтеза гема из-за мутаций гена феррохелатазы приводит к эритропоэтической порфирии.

Феррохелатаза из Bacillus subtilis состоит из двух a/b доменов с укладкой Россмана. В статье представлены две структуры: одна, образующая комплекс с N-MeMP, и другая - с металлированным мезопорфирином - Cu(MP) Структуры позволяют идентифицировать активный сайт фермента. Проанализированы конформационнные изменения белка, возникающие при связывании порфирина. Предложен механизм металлирования и конформационных изменений порфирина: феррохелатаза фиксирует пиррольные кольца B, C, D и наклоняет кольцо A для доступа металла в порфирин.

Получена структура кристалла комплекса феррохелатазы Bacillus subtilis с N-MeMP с разрешением 1.9Å. Фазовая проблема решена с помощью молекулярного замещения, R-factor - 18.1% (R-free 23.1%), все остатки соответствуют карте Рамачандрана. Для выявления металл-связывающего сайта и его влияние на связывание порфирина была кристаллизована структура феррохелатазы с N-MeMP в присутствии Cu2+ с разрешением 2.3Å, R-factor - 18.3% (R-free 25.7%).

Для апофермента измерено:

  • 27,034 рефлексов,
  • минимальное разрешение - 20.0Å,
  • максимальное - 1.8Å,
  • полнота - 94% (процент использованных рефлексов относительно всех возможных рефлексов с разрешением ниже 1.8Å),
  • R-factor - 17.7% (R-free 20.5%), их разница меньше 10%, что говорит о том, что модель не переоптимизована.

PROCHECK

94.1% остатков (отличных от Gly и Pro) попали в предпочитаемые области на карте. 

G-Factors

                                                Average
Parameter                            Score       Score
---------                            -----       -----
Dihedral angles:-
     Phi-psi distribution             0.08      
     Chi1-chi2 distribution           0.09      
     Chi1 only                        0.16      
     Chi3 & chi4                      0.38      
     Omega                            0.35      
                                                   0.21      
                                                  =====
Main-chain covalent forces:-
     Main-chain bond lengths          0.52      
     Main-chain bond angles           0.28      
                                                   0.38      
                                                  =====

     OVERALL AVERAGE                               0.28      
                                                  =====

Значения G-фактора меньше -0.5 показывают необычность признака. Так, в структуре только длины связей главной цепи -0.52.

Таким образом, программа PROCHECK показала, что структура соответствует всем ее параметрам проверки.

Asn291(A) - маргинальный остаток, на карте Рамачандрана попал в запрещенную зону.

На рисунках показано, что остаток аспарагина находится в повороте, соседствуя с двумя пролинами. Pro290 может оказывать большое влияние на главную цепь Asn291.

EDS

EDS показывает Pro227, как единственного outlier'а, RSR=21,6%.

Из рисунка видно, что остаток Pro227 плохо вписан в электронную плотность (уровень подрезки 1.5).

Заключение

Структура имеет хорошие значения R-фактора, свободного R-фактора, 94.1% остатков (отличных от Gly и Pro) попали в предпочитаемые области на карте Рамачандрана. Real-space R-value: 8.9%. Был найден маргинальный остаток Asn291(A),но его маргинальность можно объяснить необходимым условием для существования структуры, и программой EDS найден остаток Pro227, как маргинальный.
Нет подозрения на переоптимизацию (overfitting) модели: (R-free - R-factor = 2.8%, что меньше 10%).

Обзор протокола WHAT_CHECK 

  • Structure Z-scores, positive is better than average:

  1st generation packing quality :   1.0
  2nd generation packing quality :  -1.1
  Ramachandran plot appearance   :   0.2
  chi-1/chi-2 rotamer normality  :  -0.4
  Backbone conformation          :  -0.0

RMS Z-scores, should be close to 1.0:

  Bond lengths                   :   0.589 (tight)
  Bond angles                    :   0.766
  Omega angle restraints         :   0.382 (tight)
  Side chain planarity           :   0.448 (tight)
  Improper dihedral distribution :   0.762
  B-factor distribution          :   0.700
  Inside/Outside distribution    :   0.909

  • chi-1/chi-2 correlation Z-score : -0.704
 89 GLU   (  90-)  A  PRO omega poor
 112 LEU   ( 113-)  A  Poor phi/psi
 120 SER   ( 121-)  A  Poor phi/psi
 221 SER   ( 222-)  A  Poor phi/psi
 231 GLY   ( 232-)  A  PRO omega poor
 290 ASN   ( 291-)  A  Poor phi/psi
    В таблице ASN(291)A - остаток, который и на карте Рамачандрана оказался маргинальным. А вот про остаток Pro227 WHAT_CHECK ничего не сказал.

WHAT_CHECK ничего нового, особенного не показал, вопиющих ошибок-нарушений в модели не выявил.

Structural and mechanistic basis of porphyrin metallation by ferrochelatase.
Lecerof, D., Fodje, M., Hansson, A., Hansson, M., Al-Karadaghi, S.
Journal: (2000) J.Mol.Biol. 297: 221-232

Седьмой семестр

© Migur Anzhela 2012