Ресеквенирование. Поиск полиморфизмов у человека.

Индексирование референса

• Создали директорию mkdir artemisbakulin
• Скопировали референс cp chr3.fasta artemisbakliin
• Проиндексировали его: hisat2-build chr3.fasta chr3

Анализ качества прочтений

• Скопировали прочтения к себе в директорию: cp /nfs/srv/databases/ngs/Human/reads/chr3.fastq ./
• Проели анализ качества: fastqc chr3.fastq
• Обрезали с конца каждого рида нуклеотиды с качеством меньше 20, и оставили только те последоватеьности длина которых была больше 50:
  java -jar /nfs/srv/databases/ngs/suvorova/trimmomatic/trimmomatic-0.30.jar SE -phred33 chr3.fastq chr3.trimmed.fastq TRAILING:20 MINLEN:50
• Провели повторный анализ качества: fastqc chr3.trimmed.fastq

Результаты анализа:

Всего было удалено 362 прочтения, то есть около 2%. В принципе это нужно было делать, но не критично.

Картирование

Затем эти прочтения были картированы на геном.

• Картирование: hisat2 -x chr3 -U chr3.trimmed.fastq --no-spliced-alignment --no-softclip > chr3.sam
• Переход в бинарный формат: samtools view chr3.sam -bo aligned.bam
• Сортировка: samtools sort chr3.bam -T aligned -o chr3.sorted.bam
• Статистика по картированию: samtools flagstat chr3.sorted.bam > flagstat.out

Оказалось, что накартировались 99.62% ридов, это хорошо, только 79 прочтений из 20589 не смогли пройти эту операцию.

Поиск SNP

• Коллинг полиморфизмов: samtools mpileup -uf chr3.fasta -o chr3.bcf aligned.sorted.bam
• Переход из бинарного формата в текстовый: bcftools call -cv chr3.bcf -o chr3.vcf
• Получение статистики по полиморфизмам: bcftools stats chr3.vcf > stats.out
• Построение графика распределение глубины картирования полиморфизмов: plot-vcfstats -p plot_vcf stats.out

Итак всего было найдено 218 SNPs и 12 инделей.

Примеры полиморфизмов:

Базы данных snp

• dbsnp:
  annotate_variation.pl -filter -out snp138_filtered -build hg19 -dbtype snp138 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
• refgene:
  annotate_variation.pl -out refgen -build hg19 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
• 1000 genomes:
  annotate_variation.pl -filter -out 1000g -build hg19 -dbtype 1000g2014oct_all snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
• Gwas:
  annotate_variation.pl -regionanno -out gwas -build hg19 -dbtype gwasCatalog snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/
• Clinvar:
  annotate_variation.pl -filter -out clinvar -build hg19 -dbtype clinvar_20150629 snp.avinput /nfs/srv/databases/annovar/humandb.old/

Итоги анализа snp по базам данных:

Из файла refgen.variant_function можно извлечь следующие данные:

SNP попали в гены ULK4, FNDC3B

Из файла refgen.exonic_variant_function можно извлечь следующие данные о нуклеотидных заменах. Префиксом c. обозначены нуклеотидные замены, p. аминокислотные.

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon33:c.A3292G:p.K1098E 

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon24:c.G2551A:p.V851I

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon24:c.T2530A:p.L844M

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon21:c.G2143A:p.A715T 

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon20:c.T1918G:p.S640A

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon19:c.T1808C:p.L603S 

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon18:c.A1706G:p.K569R 

synonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon17:c.A1599G:p.V533V 

synonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon16:c.A1536G:p.Q512Q 

nonsynonymous SNV	ULK4:NM_017886:exon11:c.A1042G:p.S348G

nonsynonymous SNV	FNDC3B:NM_001135095:exon6:c.C536G:p.T179S,FNDC3B:NM_022763:exon6:c.C536G:p.T179S

synonymous SNV	FNDC3B:NM_001135095:exon6:c.T687C:p.H229H,FNDC3B:NM_022763:exon6:c.T687C:p.H229H 

synonymous SNV	FNDC3B:NM_001135095:exon12:c.T1374C:p.G458G,FNDC3B:NM_022763:exon12:c.T1374C:p.G458G 

В выдаче dbsnp было найдено 177 snp, имеющих rs.

О частотах можно узнать из выдачи 1000g. Частоты лежат в диапазоне между 1 и 95%. Скачать

В выдаче GWAS написано, что найденные полиморфизмы ассоциированы с высоким ростом, с высоким кровяным давлением и риском развития диабета второго типа (ссылка на статью).

Назад

©Бакулин Артемий, 2018