Практикум 9.

Поиск предков кристаллинов.

Белки кристаллины выполняют, главным образом, структурные функции. Они обеспечивают прозрачность хрусталика. Похоже, что разные группы организмов независимо решали эту задачу, и “изобретали” соответствующие белки разными способами.

В рамках задания я выбрала ε-кристаллин, предком которого является лактатдегидрогеназа В (LDH-B). Подробнее можно почитать в статье.

У утки (Anas platyrhynchos) ε-кристаллин хрусталика оказался практически идентичен лактатдегидрогеназе сердца (LDH-B) и сохраняет её ферментативную активность [1]. Авторы статьи доказали, что ε-кристаллин и LDH-B — это один и тот же белок, кодируемый единственным геном Ldh-B. В хрусталике утки этот ген сверхэкспрессируется, его продукт составляет до 10% общего белка [1].

Поскольку лактатдегидрогеназа и кристаллин являются одним и тем же белком, я нашла в UniProt запись P13743

Информация о записи:

  • UniProt AC: P13743
  • Название записи: LDHB_ANAPL (L-lactate dehydrogenase B chain)
  • Альтернативное название: Epsilon-crystallin
  • Организм: Anas platyrhynchos (Mallard)

Поиск родственных последовательностей проводился при помощи PSI-BLAST в банке Swiss-Prot с word-size = 3, остальные параметры по умолчанию. Первая итерация является по сути просто BLASTP. Всего было найдено 596 последовательностей, из которых 575 с E-value ≤ threshold. Посмотреть выдачу первой итерации можно здесь.

Большинство находок первой итерации представлено лактатдегидрогеназами (LDH) различных организмов. В качестве исключений можно отметить убиквитин-конъюгирующий фермент E2 вариант 3 (Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3), обнаруженный у Homo sapiens (AC: Q8IX04.2), Mus musculus (AC: Q3U1V6.1) и других млекопитающих, а также малатдегидрогеназу (Malate dehydrogenase), найденную, в том числе, у Bacillus israeli (AC: Q59202.1).

Наиболее значимыми находками являются лактатдегидрогеназы банкивской джунглевой курицы (Gallus gallus, AC: P00337.3), красноухой пресноводной черепахи (Trachemys scripta elegans, AC: Q9PT42.3), пресноводной черепахи - китайского трионикса (Pelodiscus sinensis japonicus, AC: Q98SK9.3). На рисунке 1 представлено выравнивание ε-кристаллина Anas platyrhynchos и лактатдегидрогеназы Gallus gallus, данная находка является наилучшей.

Рисунок 1. Выравнивание изучаемого ε-кристаллина с лактатдегидрогеназой Gallus gallus.

На второй итерации было найдено еще 155 статистически значимых (E-value ≤ threshold) последовательностей. Посмотреть выдачу второй итерации можно здесь. Находки представляют собой в основном малатдегидрогеназы различных бактерий (например, Acinetobacter baylyi ADP1 (AC: Q6F7X1.1), Thermus thermophilus (AC: P10584.1), Legionella pneumophila str. Paris (AC: Q5X2T6.1)).

На третьей итерации было найдено еще 19 статистически значимых последовательностей. Посмотреть выдачу третьей итерации можно здесь. Среди новых находок были обнаружены UDP-глюкозо-6-дегидрогеназы бактерий (например, Escherichia coli (AC: P76373.1), Salmonella enterica (AC: Q04873.1)), а также альфа-галактозидазы бактерий (Bacillus subtilis (AC: O34645.1), Thermotoga neapolitana (AC: O86960.2)).

На четвертой итерации было найдено еще 22 статистически значимых последовательности. Посмотреть выдачу четвертой итерации можно здесь. Среди находок преобладают UDP-глюкозо-6-дегидрогеназы (например, Streptococcus pneumoniae (AC: Q57346.2), Bacillus subtilis (AC: P96718.1)), альфа-галактозидазы (например, Escherichia coli (AC: P06720.1), Salmonella enterica (AC: P30877.2)), а также мальтозо-6'-фосфат-глюкозидазы различных бактерий (например, Clostridium acetobutylicum (AC: Q97DP6.1), Bacillus subtilis (AC: P54716.1)).

На пятой итерации было найдено еще 22 статистически значимых последовательности. Посмотреть выдачу пятой итерации можно здесь. Среди находок — UDP-глюкозо-6-дегидрогеназа бактерий (например, Rickettsia prowazekii (AC: O05973.1), Pseudomonas aeruginosa (AC: O86422.2)), UDP-N-ацетил-D-маннозамин-дегидрогеназа архей (например, Methanocaldococcus jannaschii (AC: Q57871.1), Pyrococcus horikoshii (AC: O59284.1)), а также UDP-глюкозо-6-дегидрогеназа эукариот — растений (например, Oryza sativa (AC: Q2QS13.1)), нематоды Caenorhabditis elegans (AC: Q19905.1), дрозофилы Drosophila melanogaster (AC: O02373.1) и даже позвоночных (например, быка Bos taurus (AC: P12378.2) и орангутана Pongo abelii (AC: Q5R7B3.1)).

На шестой итерации не было найдено новых последовательностей. Посмотреть выдачу шестой итерации можно здесь.

Выводы

В ходе выполнения практикума был проведён поиск эволюционных предков и дальних родственников ε-кристаллина утки (Anas platyrhynchos, UniProt AC: P13743) с использованием PSI-BLAST по базе данных Swiss-Prot.

Анализ результатов поиска:

  1. Уже на первой итерации (BLASTP) подавляющее большинство из 575 найденных значимых последовательностей было представлено лактатдегидрогеназами позвоночных. Наилучшее выравнивание (97.3% идентичности) получено с LDH-B (Gallus gallus), что подтверждает высокую консервативность и общее происхождение этих белков у птиц.
  2. Последующие итерации PSI-BLAST позволили выявить более дальних родственников, некоторых из которых являются NAD-зависимыми дегидрогеназами. На второй итерации было найдено дополнительно 155 последовательностей, среди которых доминировали малатдегидрогеназы бактерий (Acinetobacter baylyi, Thermus thermophilus). На третьей итерации появились UDP-глюкозо-6-дегидрогеназы (Escherichia coli, Salmonella enterica) и альфа-галактозидазы. Четвёртая и пятая итерации расширили спектр находок за счёт мальтозо-6'-фосфат-глюкозидаз, UDP-N-ацетил-D-маннозамин-дегидрогеназ архей, а также засчет белков в эукариотических организмах: растениях (Oryza sativa), беспозвоночных (Caenorhabditis elegans) и позвоночных (Bos taurus, Pongo abelii).
  3. Всего в результате шести итераций PSI-BLAST было найдено 793 уникальных гомологов ε-кристаллина, удовлетворяющих порогу значимости. Из них большая часть являются лактатдегидрогеназами и малатдегидрогеназами различных организмов. Оставшиеся находки включают другие UDP-глюкозо-6-дегидрогеназы, UDP-N-ацетил-D-маннозамин-дегидрогеназы, альфа-галактозидазы, мальтозо-6'-фосфат-глюкозидазы, а также убиквитин-конъюгирующий фермент E2 вариант 3.

Таким образом, PSI-BLAST подтвердил принадлежность ε-кристаллина к лактатдегидрогеназам и выявил его эволюционное родство с NAD-зависимыми дегидрогеназами, охватывающими все бактерий, архей и эукариот.

Список литературы:

[1] Hendriks W, Mulders JW, Bibby MA, Slingsby C, Bloemendal H, de Jong WW. Duck lens epsilon-crystallin and lactate dehydrogenase B4 are identical: a single-copy gene product with two distinct functions. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(19):7114-7118. doi:10.1073/pnas.85.19.7114